溶菌酶是1922 年Fleming[1]在人体唾液、眼泪中发现的蛋白质,在食品中多用于食品防腐剂或果蔬保鲜[2]。目前研究的溶菌酶多来源是新鲜鸡蛋清[3]。此外,因溶菌酶具有易形成单晶的特性,可以作为模型蛋白来探究蛋白质的降解、聚集[4]以及组装过程[5]。通常溶菌酶的分离纯化方法主要包括结晶法、离子交换法、膜色谱法和反胶团萃取等方法,其中结晶法可以得到适合单晶衍射的优良蛋白质单晶,进而进行生物大分子的结构测定。
溶菌酶结晶主要方法有批量结晶、液-液扩散结晶、蒸汽扩散结晶和透析结晶,为了获得更高质量结晶与增大结晶产量,需要不断探究结晶条件[6]。1999 年,离子液体开始应用于蛋白质结晶研究中,其具有多重作用,可以控制蛋白质晶核的生成数量[7],提高获得高质量单晶的概率。离子液体是具有特殊结构、没有电中性的分子,其完全由阳离子和阴离子构成[8],室温下离子液体具有饱和蒸汽压低、溶解能力强、重复使用、不易燃及热稳定性好的优点[9]。如图1 所示,目前已有由四烷基铵基离子液体形成的ABS 应用在溶菌酶的分离和回收中[10],溶菌酶回收率高达99%。
图1 离子液体的ABS 系统提取溶菌酶[10]
Fig.1 Extraction of lysozyme by ABS system of ionic liquid[10]
丹媛媛[11]研究发现,碱性离子液体可以用于溶菌酶的结晶,通过调节离子液体的添加量可以控制溶菌酶结晶的速度、大小和质量。目前,关于离子液体在促进溶菌酶结晶,改善溶菌酶晶体形态、制备适合X 射线衍射的高质量晶体,及如何进一步提高溶菌酶稳定性并强化溶菌酶活性等方面已经成为相关领域的研究热点。本论文综述了离子液体介导溶菌酶结晶的热力学和动力学行为与机理,分析了离子液体介导的溶菌酶结晶过程、晶体形态及活性的影响因素,以期为溶菌酶结晶过程调控及高质量溶菌酶晶体的制备理清思路,方便研究人员的后续深入探究。
1 溶菌酶结晶研究进展
1.1 蛋白质结晶
高质量蛋白质晶体可以用于生物大分子的性质和结构分析,结合大分子X 射线晶体学数据在原子水平上研究特定药物与蛋白质靶标的特定相互作用,为药物设计提供思路[12]。Kwon 等[13]采用了连续结晶模型来预测蛋白质晶体成核、生长和溶解过程。目前蛋白质结晶过程的探测技术仍在不断改进,聚焦将自动化反应器与实时原位分析仪耦合使用,以此来确定不同因素对蛋白质晶体的生长、形态变化等的影响机制,获得过程更加可控的高质量蛋白质晶体。
此外,蛋白质结晶易受到多种因素的影响,甚至杂质的存在也能促进结晶[14]。对于一些影响因素的作用机理仍未完全澄清,导致蛋白质结晶形成过程不易调控,结晶效率和产率较低。寻找促进蛋白质结晶的与调控手段,除了从物理、化学和异相成核法3 个角度着手,尚且需要更加普适的方法[15]。从理论上探究蛋白质晶体的生长过程、晶体形态及影响结晶的因素,其对于探索生命本源具有重要意义。当前大多数蛋白质结晶研究仍以溶菌酶为模型蛋白,通过研究溶菌酶结晶过程及晶体结构,来深入探究蛋白质结晶的机理及奥秘。
1.2 溶菌酶结晶
1.2.1 溶菌酶结晶影响因素
溶菌酶结晶可以制备满足X 射线衍射要求的单晶,用于蛋白质晶体结构的探测。影响溶菌酶结晶的因素如表1 所示,温度[16]、pH 值[17]、添加剂[18]、溶菌酶种类[19]、生长方式[20]、蒸发速率[21]和超声[22]等可以改变溶菌酶晶型、大小及形态。
表1 影响溶菌酶结晶因素
Table 1 Factors affecting lysozyme crystallization
溶菌酶类型 因素 产生影响 参考文献鸡蛋清溶菌酶 温度 0.4 K 的温度范围内微小周期性变化对结晶成功率有显著影响 [16]鸡蛋清溶菌酶 pH 值 在pH＜4.5 时,溶菌酶结晶相图中亚稳区和成核区之间的边界向左移动,在pH＞4.5 时,边界向右移动 [17]鸡蛋清溶菌酶 添加剂(甘油,PEG 1000 和甘氨酸)在pH=5 下,添加10%(质量分数)甘油、10%(质量分数)PEG 1000和1 mol·L-1甘氨酸不影响溶菌酶的天然构象,但强烈影响结晶区域的位置、溶菌酶溶解度、晶体大小和形态[18]鸡蛋清溶菌酶、芽孢杆菌溶菌酶、人源溶菌酶溶菌酶种类 对于不同物种来源的溶菌酶,溶解度变化规律存在较大差异,最适结晶条件和形成的晶型也存在差异 [19]鸡蛋清溶菌酶 低压蒸发 鸡蛋清溶菌酶在低压和适中的沸腾温度下,从其缓冲水溶液中结晶,此时酶的生物活性保持不变,并表现了高结晶产率 [20]鸡蛋清溶菌酶 金属辅助和微波加速蒸发结晶在金属辅助和微波加速蒸发结晶技术下,观察到溶菌酶晶体的四方形状,但发现溶菌酶晶体的质量在使用微波加热略有下降 [21]溶菌酶 超声 超声可以加速成核,降低溶菌酶晶体形成的能量势垒,诱导成核,溶菌酶晶体尺寸更加均匀 [22]
目前,影响溶菌酶结晶的因素仍被不断地挖掘,同时探测溶菌酶结晶动力学因素的方法也在不断改进。例如,采用实时中子衍射探测溶菌酶结晶动力学,小角度散射信号可监测溶液中溶菌酶分子的消耗,并用Johnson-Mehl-Avrami-Kolmogorov 模型来拟合溶菌酶的晶体生长数据[23],这些研究手段为溶菌酶结晶动力学及影响因素分析提供了新思路。最新的一项研究中,在高浓度水凝胶中,通过化学交联、在溶菌酶相邻分子间引入二硫键交联,可以提高溶菌酶晶体的结晶稳定性[24]。因此,调节影响溶菌酶晶体稳定性及结构的因素对于实现溶菌酶结晶新策略的开发至关重要,可以实现根据不同需要来调控影响因素,进而获得适合需求的溶菌酶晶体。
1.2.2 溶菌酶结晶使用的添加剂
在促进溶菌酶结晶的多种方法中,添加剂可以调控溶菌酶结晶过程,提高晶体的稳定性同时添加剂具有选择性较多、安全性高的优点。
已报道的文献表明,添加剂对溶菌酶晶体的构象及形态具有影响,Baird 等[25]研究表明,添加强电解质的pH 值缓冲溶液可改变溶菌酶结晶速率,离子强度对结晶动力学具有显著影响。Petrova 等[26]研究显示,沉淀剂仅影响结晶过程,溶菌酶分子在溶液中的最终构象并不依赖沉淀剂种类。Filipa等[27]在振荡混合流下,观察到了溶菌酶四方晶体、斜方晶体和针状晶体,甚至微晶晶体及沉淀物。如图2 所示盐浓度对溶菌酶晶体形态产生显著影响,逐渐增加盐浓度会导致晶型发生改变,证实了离子强度对溶菌酶结晶过程及晶体形态具有调控作用。
图2 盐浓度对溶菌酶晶体形状影响[27]
Fig.2 Effect of salt concentration on shape of lysozyme[27]
已有研究也显示,添加剂对于溶菌酶晶核的形成及晶体生长具有显著作用。在晶核形成过程中,在固液界面处形成双电层,添加剂浓度和离子会影响双电层厚度,进而影响溶菌酶晶核的形成。因此,添加剂具有改变蛋白质成核速率的效应[28]。
最新研究表明,溶菌酶晶核形成前,除了存在单体形式,还存在二聚体、八聚体等形式[29],低聚体是晶体的簇前体,当低聚体达到成核的临界水平会聚集成晶体。图3 模拟了在加入添加剂后,溶菌酶由于水合离子的作用产生了特定的掺入位点[30],然后形成八聚体,之后进一步形成溶菌酶晶核。通过小角X 射线散射研究沉淀剂氯化锂对晶核形成过程的影响,发现结晶溶液中八聚体体积分数的减小降低了晶体形成的可能性[31],证实八聚体对晶核形成具有较大影响。分子动力学模拟显示,低聚物的稳定性取决于其结构中阴离子和阳离子种类[32],氯离子具有稳定溶菌酶溶液中二聚体和八聚体的作用,因此,含有氯离子的添加剂对溶菌酶结晶具有促进作用。
图3 溶菌酶预结晶状态示意图
Fig.3 Schematic diagram of lysozyme pre-crystallization state
促进溶菌酶的添加剂种类众多,目前也有报道使用DNA 作为聚合物添加剂来增强溶菌酶的结晶,使用鲑鱼DNA 和鲱鱼DNA 研究表明,在低溶菌酶浓度下溶菌酶结晶的成功率提高且缩短了结晶时间[33]。添加铂纳米颗粒(PtNPs)[34] 和金纳米颗粒(AuNPs)[35],也具有促进溶菌酶晶体成核,改善晶体形态、尺寸的作用。此外外加电场、高压、温度与添加剂共同使用都可以对加强对于结晶过程调控。可见盐离子的种类、离子强度对于溶菌酶结晶过程具有重要影响,合适的添加剂可以提高溶菌酶结晶的产生速率得到合适的溶菌酶晶体。但是如何选择合适的添加剂则是一个难题,离子液体具有可以设计阴阳离子的特点,极大地满足了添加剂的灵活性与多样性;此外离子液体的生物相容性高,可维持蛋白质的三维结构,其亲疏水性可通过选择不同的阴阳离子进行调节[36]。因此采用离子液体作为促进溶菌酶结晶的添加剂具有广阔的前景。
2 离子液体介导溶菌酶结晶
2.1 离子液体介导的溶菌酶结晶过程
离子液体一般由体积差别大且不对称的阴阳离子组成,常温下通常为液体。表2 列出了常见离子液体的阴阳离子,体积较大阳离子包括咪唑盐离子、季铵盐离子、喹啉盐离子和吡咯盐离子等,阴离子有多核阴离子和通常呈现碱性的单核阴离子。由于有机阳离子和无机阴离子的多样性,可以设计数量庞大的不同类型的离子液体[37]。
表2 离子液体中常见的阴阳离子[37]
Table 2 Common anions and cations in ionic liquids[37]
离子种类 化学结构阳离子images/BZ_43_518_1480_617_1653.png吡啶离子images/BZ_43_738_1517_999_1616.png咪唑离子images/BZ_43_1101_1481_1238_1651.png哌啶离子images/BZ_43_1370_1472_1570_1661.png喹啉离子images/BZ_43_1719_1468_1823_1664.png吗啉离子images/BZ_43_1979_1495_2180_1638.png季铵盐离子阴离子images/BZ_43_466_1746_744_1892.png双(三氟甲烷)磺酰亚胺离子images/BZ_43_857_1779_1105_1858.png双(三氟甲烷)酰胺离子images/BZ_43_1265_1777_1449_1920.png四氟硼酸离子images/BZ_43_1580_1815_1886_1882.png二氰铵离子I-、Br-、Cl-卤根离子
随着离子液体的组成及性质不断演变,第3 代离子液体主要是基于离子液体的生物活性和稳定性,将离子液体用作生物材料的介质[38],充当相容性良好的蛋白质稳定剂[39]。更新到第4 代离子液体,研究者发现离子液体性质并不受简单混合规则的支配,与普通盐溶液不同,会受溶液中溶剂的影响,离子液体对于离子的成对、聚集体以及形成这些结构扮演重要角色[40]。离子液体具有普通的盐溶液不具有的特性,其促进溶菌酶结晶的机理仍有待深入地研究。此外,离子液体对于溶菌酶晶体的稳定性、晶核形成与成长、晶体活性等都具有特殊的影响,以下为离子液体在介导溶菌酶结晶方面的最新进展。
2.1.1 离子液体对溶菌酶稳定性影响
肽和蛋白质晶体通常至少含有50%的溶剂分子,与无机晶体的形成相比,蛋白质等大分子形成晶格触电的能力较弱。离子液体与蛋白质具有静电相互作用、疏水性相互作用、形成氢键的能力[41],可以与生物大分子产生相互作用,对蛋白质的分离、稳定性及促进蛋白质结晶有重要影响[42]。
离子液体可以保持溶菌酶的三维结构,提高热稳定性。Weaver 等[43]的研究表明,溶菌酶的热稳定性与水合磷酸二氢胆碱离子液体的浓度成正比。将离子液体添加到含有溶菌酶的水溶液中,可防止未折叠的蛋白质在高温下不可逆地聚集。如表3 所示,热处理后,溶菌酶的活性不同离子液体的种类和浓度有关[44],但是和其他添加剂相比,溶菌酶的热稳定性仍然增加。
表3 添加不同离子液体后热处理溶菌酶的活性[44]
Table 3 Activity of lysozyme after heat treatment after adding different ionic liquids[44]
离子液体 结构 剩余活性/%0.10 mol·L-1[Emim][Tf]images/BZ_44_550_697_886_811.png95.35 0.15 mol·L-1[Emim][BF4]images/BZ_44_534_860_902_986.png87.03 0.15 mol·L-1[Emim][Cl]images/BZ_44_540_1032_896_1153.png79.19
离子液体提高了溶菌酶的热稳定性,与影响蛋白质分子之间相互作用并改变晶体表面能相关。
Wang 等[45]采用差示扫描量热法(DSC)分析了离子液体介导的溶菌酶晶体的热稳定性,结果显示,添加离子液体的溶菌酶热变性温度升高,吸热焓值增大,推测离子液体对溶菌酶晶体热行为的影响可能与溶液中溶菌酶分子之间的相互作用有关。傅里叶变换红外光谱结果显示,添加离子液体后溶菌酶晶体的聚集显著降低,溶菌酶晶体内分子间氢键相互作用数量减少。傅里叶变换拉曼光谱结果显示,α-螺旋和β-折叠是溶菌酶的主要结构,添加不同离子液体,会改变溶菌酶分子在结晶过程舒展程度,导致二级结构变化[46]。
此外最新研究表明在蛋白质、水、离子液体体系中,虽然离子液体与周围的水分子具有很强的电场相互作用,但水-离子液体相互作用不会破坏水-水氢键相互作用,水的氢键在离子液体中保持相对不受干扰状态[47]。而离子液体中离子与水分子竞争蛋白质,同时离子本身也被水分子溶剂化,因此易形成氢键的离子可能具有较厚的水分子壳,减少与蛋白质接触,增加稳定性[48]。因此,离子液体可能主要通过影响溶液中溶菌酶分子的相互作用,改变溶菌酶晶体的二级结构,进而影响晶体的稳定性。
2.1.2 离子液体对溶菌酶溶解度的影响
离子液体可改变溶菌酶的溶解度。溶解度随离子液体种类和浓度的变化。通常情况下,室温下离子液体均可以与所有比例的水混溶[49],但与蛋白质形成对应的三元混合物,混合顺序尤为重要,即影响溶菌酶三元混合物溶解度的因素较多。于筱溪[50]的研究表明,高浓度[C8mim]Br 会在溶菌酶溶液中聚集形成胶束,使溶菌酶的构象发生一定变化,因此溶菌酶表面亲水残基增多,疏水性降低,溶解度增大。
离子液体和溶菌酶的分子相互作用影响了溶解度。Alves 等[51]实验显示[C4F9SO3]-离子聚集在蛋白质表面,会优先与蛋白质中阳离子和非极分子相互作用。除此之外,部分离子液体与溶菌酶还可能存在酶促反应,增加溶菌酶的溶解度。离子液体对溶菌酶结晶热力学和溶解度具有特定的影响,需要根据不同种类的离子液体进行具体分析。
2.2 离子液体介导溶菌酶结晶机理
利用离子液体介导溶菌酶结晶,主要是将离子液体作为添加剂来促进结晶。四乙基溴化铵能够在最宽的浓度范围内[9%～27%(质量分数)]诱导溶菌酶结晶[42],且晶体数量、形态和尺寸随离子液体浓度而变化。Hekmat 等[52]研究了5 种水溶性无卤烷基铵基离子液体作为添加剂,使溶菌酶晶体变多、晶型减少,强化溶菌酶结晶动力学。除此之外,烷基铵基离子液体会使溶菌酶晶体的生长更快,形成的晶体更致密,在2 h 内可以获得97% 的产率[53]。乙基硝酸铵(EAN)与蛋白质具有疏水相互作用、离子相互作用以及形成氢键能力,Garlitz等[54]研究证实了其能够广泛应用于蛋白质结晶中,用作添加剂促进蛋白质结晶,甚至可用作递送体将配体递送到蛋白质晶体中。
溶菌酶晶体的成核和生长是一个复杂的过程,受许多因素的影响,尤其是离子液体的种类、浓度、温度等,都会对晶体成核产生较大的影响。成核是蛋白质结晶的关键步骤,目前主要分为包括经典成核、两步成核和异相成核等几种常见的成核方式。Wang 等[55]通过计算晶核临界吉布斯自由能发现,[Dmim]I 增强了溶菌酶分子之间的吸引力,促进溶菌酶形成疏水性位点,导致分子碰撞几率增加,临界核的大小和分子数减少,成核速率增加。离子液体溶液的固有水合特性也有利于离子与蛋白质依据亲水或者疏水水合作用结合,静电相互作用也可以使稳定溶液中的蛋白质降低,进而促进蛋白质成核[56]。此外,在溶解度有限的溶液中,离子液体增加蛋白质水合能力,有利于溶菌酶结晶析出。
离子液体促进溶菌酶晶核的形成,可能与其对溶菌酶二级结构的影响相关。二级结构是蛋白质三维构象的基础,影响蛋白质分子之间的相互作用以及晶体成核过程分子的自排列。离子液体通过将溶菌酶分子排列成线性样来影响溶菌酶成核,使其从聚集体型转变为纤维型,使溶菌酶分子在溶液中更加容易有序重排,显著加快成核速率[57]。添加少量离子液体会使溶菌酶总螺旋含量增加,α 螺旋百分比上升使形成溶菌酶分子排布更加密集,晶体分子更稳定。除此之外,溶菌酶构象的微小变化也可能带来暴露疏水基团的分布变化,影响溶菌酶分子之间的疏水相互作用,因此通过这些相互作用的结合,可以促进溶菌酶的结晶。
但Wang 等[58]使用原位傅里叶变换红外光谱探究了在结晶过程溶菌酶二级结构的变化,结果如图4 所示,[C4mim]Cl 存在下,溶菌酶结晶过程中α-螺旋含量降低,β-折叠结构含量增加,有利于溶菌酶分子之间排斥作用的形成,同时增加了溶菌酶与水分子之间水合能力。研究中二级结构变化的结果不同,这可能是由于不同离子液体的阴离子和阳离子的变化以及所应用的其浓度不同造成的,可见离子液体对于介导溶菌酶结晶的作用会随浓度与离子液体种类改变,丰富了离子液体的选择,也需要更加深入地探讨。
图4 添加离子液体探究溶菌酶结晶过程
Fig.4 Adding ionic liquid to explore the mechanism of lysozyme crystallization process
Muldoon[59]研究发现,增加离子液体的浓度,会导致晶体成核密度降低并改善晶体质量。但溶菌酶添加过量也会产生负面效应,如果添加超过10 mol·L-1的[bmim][NO]离子液体,则溶菌酶聚集状态被抑制,即溶菌酶二级结构部分折叠,三级结构被破坏[60]。将离子液体与其他结晶方法结合,其仍然具有良好的促进晶体成核的能力,Kowacz 等[61]研究发现,表面蚀刻功能化离子液体的结晶硫酸钡(BaSO4),可以在远低于晶体生长所需浓度诱导蛋白质成核,并且可以缩短成核时间、提高生长速率。如[Emim]Br、[Bmim]Br 和[Emim]BF 等离子液体可增强溶菌酶的成核能力,同时离子液体可以减慢蒸汽传输速率,进而调控晶体的生长速度[62]。有研究显示, 以亲水离子液体 1,3-丁基氯化咪唑(BBimCl)为添加剂,采用悬滴蒸气扩散结晶方式制备溶菌酶晶体,溶菌酶的溶解度增加导致过饱和阈值升高,进一步导致溶菌酶过饱和过程较慢,为促进成核创造有利环境,并为溶菌酶晶体生长速度的可控提供了可能性[63]。
但离子液体与蛋白质相互作用机制仍然存在有待澄清的方面,离子液体促进结晶的可重复性和特殊性还需要进行深入的研究。未来利用离子液体的可设计性,用于蛋白质复合物的分离提取,为增溶试剂的选择提供新思路[64]。
2.3 离子液体对溶菌酶晶体形态的影响
离子液体影响溶菌酶晶体的形态。传统的批量结晶通常会出现部分晶体形态的缺陷,添加离子液体能够降低晶体缺陷的数量。
Han 等[65]的报道显示,在添加17 ～33 mol·L-1浓度的EAN 离子液体后,溶菌酶晶体的大小和形状发生了明显的改变。1-乙基-3-甲基咪唑阳离子和几种阴离子组成的水溶性非质子离子液体,可防止未折叠的溶菌酶在高温下不可逆地聚集,增加晶体形态的稳定性[66]。而且添加咪唑阳离子中的含氮离子,其连接不同长度的烷基,同样制备的晶体形态各有不同,对晶体长径比有显著影响。图5 为Tao等[67]实验的晶体的衍射图,离子液体加入不仅提高了溶菌酶晶体质量,与未加入离子液体相比,还可以观察到更多、更清晰的衍射点,具有更高的分辨率。
图5 添加离子液体提高溶菌酶晶体质量[67]
Fig.5 Adding ionic liquid to improve the quality of lysozyme crystal[67]
离子液体种类对溶菌酶晶体的形态也会产生影响。有研究表明,与无离子液体相比,加入离子液体的溶菌酶晶体的形态和大小明显改善[68]。如图6 所示,在无添加剂、[C4mim]Cl 和[dmim]I 存在下,溶菌酶晶体形态不同,在[C4mim]Cl 存在下溶菌酶的晶体形态美观,在加入[dmim]I 的情况下,观察到针状溶菌酶晶体。溶菌酶晶体从板状向针状转变的原因可能是离子液体中阳离子[C4mim]和[dmim]的差异。此外,离子液体浓度也是影响溶菌酶晶体形态和大小变化的因素,图6(d)、图6(e)和图6(f)分别是加入不同浓度的[C4mim]Cl 晶体,呈棱镜状,[C4mim]Cl 的加入浓度越高,晶粒尺寸越小,可见适当的浓度更加有利于晶体生长。
图6 加入离子液体的溶菌酶晶体的形态改变[68]
Fig.6 Morphological changes of lysozyme crystal added with ionic liquid[68]
2.4 离子液体对溶菌酶晶体活性的影响
离子液体影响溶菌酶晶体的活性,由于离子液体具有比无机盐亲和力更高的阳离子和阴离子,因此,其抑制了酶和溶剂的相互作用,可以保留较高的溶菌酶活性[69],但决定酶活性的功能区的稳定性会随着离子液体浓度的增加而降低[70]。
特定离子液体有利于提升溶菌酶晶体活性,如添加1%的[C4mim]Cl 和[C4mim]Br 均能提升晶体的活性[71]。溶菌酶晶体在结构上的差异会影响其在溶液中的溶解性质和构象,并最终对活性产生影响。酸性条件下,离子液体的含量与溶菌酶活性增强呈正相关[72],但是随着pH 值的增加,离子液体对酶活性的增加逐渐转为抑制作用,电中性时有明显的活性增强作用,继续增大逐渐转为抑制作用[73]。酶动力学研究表明,在甲酸乙基铵(EAF)、甲酸丙基铵(PAF)、2-甲氧基乙基铵(MOEAF)和甲酸乙铵(EtAF)这4 种离子液体存在下,蛋白质活性都会增加,其中甲酸乙铵离子液体的增加最为显著,活性是对照组的6 倍[74]。有研究显示,铵基离子液体不仅可以促进溶菌酶晶体成核,还可用于失活后溶菌酶活性的恢复[75]。而且离子液体有利于溶菌酶在室温下长期储存,研究表明从高离子液体浓度中解冻的溶菌酶可以完全恢复其活性,有利于长期储存[76]。
2.5 离子液体在溶菌酶结晶中的研究进展
将离子液体添加到蛋白质溶液中,同时筛选蛋白质和离子液体浓度,可以得到更加优质晶体。因此,开发特定的离子液体作为添加剂,专门用于大分子结晶具有广阔前景[77]。
离子液体介导溶菌酶结晶具有许多优势。首先,使用离子液体作为蛋白质结晶的添加剂,可以获得更好的适合X 射线衍射的晶体,研究显示离子液体可以将非刻面蛋白质晶体(即针状、球状体、海胆和颗粒状沉淀物等) 升级为刻面2D 或3D晶体[78]。
其次离子液体有助于提高结晶稳定性及重现性。质子型离子液体中的质子能够产生氢键网络,在蛋白质结晶中应用中能够产生特殊的物理化学特性,包括当作缓冲介质调节pH 值。将10 种质子离子液体与JCSG+稀疏基质筛网一起掺入添加剂,用于溶菌酶、葡萄糖异构酶和胰蛋白酶的结晶,当浓度为100 ～200 mmol·L-1时产生明显影响,可有效增加蛋白质晶体的尺度和质量,并改善结晶的重现性[79]。
离子液体作为添加剂不仅可以降低蛋白质严苛的结晶条件,来获得高质量的蛋白质晶体,还可以在许多杂蛋白存在的情况下,实现目标蛋白的选择性结晶。研究表明BBimCl 存在下,离子液体中阳离子通过2 个色氨酸残基(W62 和W63)和1 个天冬氨酸残基(D101)与蛋白质结合而不改变酶构象,而且能够实现从复杂样品基质(例如蛋清)中直接结晶溶菌酶,这为离子液体作为添加剂介导蛋白质结晶新方法的开发提供新思路[63,80]。
除此之外,部分离子液体还参与促进蛋白质折叠、控制蛋白质聚集和结晶稳定性,还具有纯化和生物催化蛋白质,以及修饰蛋白质结构的等功能。
但同时离子液体介导溶菌酶结晶也存在部分的局限性。首先并非所有离子液体对于蛋白质结晶都具有促进作用,许多离子液体会破坏蛋白质结构和活性的稳定性。离子液体中如极性、烷基链长、疏水性和黏度等物理化学性质,对蛋白质稳定性都有不同的影响。而且对于离子液体诱导的蛋白质聚集作用的机理探讨仍然不完整[81],仍然需要进一步的研究来深入了解离子多样性、复杂的相互作用以及离子液体浓度的影响,建立离子液体对蛋白质聚集影响的一般规则[82]。
其次,水对于离子液体介导溶菌酶结晶的作用具有重要影响。纯离子液体、水合离子液体溶液和稀释离子液体与蛋白质产生的相互作用不同,进而对于蛋白质有不同的影响和产生不同的性质[83],因此需要不断优化离子液体的配比。同时离子液体作为极性溶剂,具有极强的水溶性,而且部分离子液体存在毒性,这意味着必须评估和监测它们对环境的影响[84]。
最后,部分离子液体是高度官能化的分子,成本明显高于传统溶剂。因此,需要使用具有特定理想性质但不需要复杂合成的离子液体来降低成本。
在未来发展中,由于离子液体可以提供的高提取性能和选择性,还可以应用于蛋白质的固相萃取,即作为聚(离子液体)和负载离子液相以实现蛋白质分离纯化。除此之外,不同离子液体的混合物可以更好地增强蛋白质稳定性,在离子液体的混合物中,几个离子之间发生了未识别的相互作用,这些相互作用使混合物具有独特的溶剂性质[85]。因此未来研究还可以探索不同种类离子液体混合的特性。
离子液体对于除溶菌酶以外的蛋白质也具有丰富的作用,如含磷酸盐的离子液体与肌红蛋白多肽链具有相互作用,可以增加肌红蛋白稳定性。ILs还显示会影响葡萄糖异构酶的结晶和X 射线衍射分辨率,部分离子液体作用下产生更大的晶体,晶体的形态发生变化[86]。非质子离子液体可作为蛋白质生物偶联的新型反应溶剂,而且可以较大限度保持蛋白质功能[87]。
因此,未来的研究应该通过针对目标蛋白质/酶和/或主要污染物设计环保、绿色高效的离子液体,使其具有高生物相容性、低毒性和高可回收性,从复杂来源纯化蛋白质,得到更加优质的结晶。同时将多种离子液体混合探究其性能的叠加。离子液体的独特性质还具有更加广阔的应用等待探索,不仅可以用于溶菌酶等蛋白质结晶,对于蛋白质的活性提取都具有良好的作用。
3 结语与展望
使用离子液体作为溶菌酶结晶添加剂,可以明显地改善晶体的形态、大小,得到更加合适X 射线衍射的晶体,用于结构分析。溶菌酶晶体作为蛋白质晶体结构及构效关系研究中的模型蛋白,为蛋白质结晶方式的开发及应用提供了理论指导。但是,离子液体对溶菌酶结晶过程调控的机理还需进一步地探索,未来可以采用中子衍射、Johnson-Mehl-Avrami-Kolmogorov 模型等来探究结晶动力学,实时监测溶菌酶的结晶过程,其将为溶菌酶结晶动力学及其促进晶体生长的机理研究提供新思路。此外,离子液体优良的性质,不仅应用于制备高质量的溶菌酶晶体,还可以增加溶菌酶的活性及改善晶体的稳定性,也可以将离子液体应用于其他生物大分子活性及结晶过程调控中,进一步拓展离子液体在蛋白质等生物大分子结晶领域的应用。当然离子液体的极强水溶性与毒性也存在环境安全隐患,所以未来研究旨在开发一种高效、具有成本效益、可持续发展的绿色的离子液体。
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