植物病害的发生、流行是限制农作物安全生产的重要因素,其中植物病原真菌引起的危害最为广泛、严重[1]。很多病原菌引起病害与其产生的毒素密切相关,毒素可破坏植物组织,抑制光合作用和呼吸作用,造成植物缺水、萎蔫、枯黄等,是病原菌分泌用来协助自身侵染的“化学武器”[2,3]。因此,研究、鉴定病菌产生的毒素物质,是了解病菌致病机制的重要途径,也是开发毒素抑制型杀菌剂的必要前提。
植物病原菌毒素的化学结构多样,包括酚类、有机酸、肽、聚酮类、二氢呋喃酮等[4]。例如,酚类毒素对羟基苯乙酸(p-Hydroxyphenylacetic acid,HPAA)、对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid,HBA)、对羟基苯甲醛(p-Hydroxybenzaldehyde,HBAld)、对羟基苯乙醇(Tyrosol)、间苯二酚(Resorcinol)、4-甲氧基苯酚(Mequinol)等是由葡萄白腐病菌等病原菌代谢产生的植物毒性代谢产物,对寄主植物具有明显的致病活性[5-7]。呋喃类毒素5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural,HMF)和2,5-呋喃二甲醇(2,5-Furandimethanol,BHMF)可由Stilbocrea macrostoma等病原菌代谢产生,对寄主植物也具有较强的毒素活性[8,9];展青霉素(Patulin,PAT)、赭曲霉素A(Ochratoxin A,OTA)分别是扩展青霉、赭曲霉等分泌的毒性较强的霉菌毒素[10,11];蜂蜜曲菌素(Mellein)是葡萄座腔菌等病原菌的主要毒素成分,可引起苹果叶片枯萎与枝条褐变[12,13]。分析、鉴定这些致病毒素成分,对于揭示病原与寄主互作的化学因素、针对性地开发防控药剂至关重要。
目前对于致病毒素的鉴定,主要采用分离纯化后多谱学验证的方法[14]。获得足够量的纯品,对研究人员的专业技术能力要求较高,需进行大批量发酵物的培养,使用大量有机溶剂,分离步骤还涉及柱色谱、薄层色谱、制备液相色谱等技术[15]。纯化品得到后,其结构鉴定需要核磁共振波谱、质谱、红外光谱等仪器分析技术[16]。因此,病原菌毒素的鉴定工作,适合于专业的天然产物化学实验室,但对常涉及毒素研究的植物保护专业人员难度较大。
高效液相色谱法(HPLC)因其分离效能高、灵敏度强、适用性广的特点,广泛用于微生物发酵液中代谢产物成分的定性鉴定(保留时间、紫外光谱)和定量分析(外标、内标定量法等)[17]。Richard液体培养基是真菌发酵生产常用的合成型液体培养基,组成均为化学试剂(基础无机盐与蔗糖),空白背景简单、杂质少,适合作为真菌次级代谢产物快速鉴定的培养基质[18]。本研究以Richard液体培养基作为病原菌的培养基质,通过优化样品前处理步骤及色谱分离、化合物鉴定条件,建立了快速鉴定植物病原菌培养液中11种致病毒素(2,5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、展青霉素、对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸、对羟基苯甲酸、间苯二酚、对甲氧基苯酚、蜂蜜曲菌素、赭曲霉素A)的高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-DAD)分析方法,以期提供一种简便、快速鉴定病菌能否产生这些毒素的工具,推进对病菌致病化学因素的解析及病害新型防控药剂的研发。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
LC-2030 D Plus型高效液相色谱仪(包含四元低压梯度输液泵、自动进样器、二极管阵列(DAD)检测器和LabSolution色谱数据处理工作站)、Inert Sustain AQ-C18型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm,日本岛津公司)。
2,5-呋喃二甲醇(99%,CAS:1883-75-6)、5-羟甲基糠醛(99%,CAS:67-47-0)、甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)、磷酸(色谱级)、超纯水、葡萄糖(分析纯,99%)、蔗糖(分析纯,99%)、Na2SO4(分析纯,99%)、(NH4)2SO4(分析纯,99%)、NaCl(分析纯,99.5%)、PSA(40～63 μm)、C18(40～63 μm)、Florisil(60～100目)、GCB(120～400目)(国药集团化学试剂有限公司);对羟基苯甲酸(99%,CAS:99-96-7)、对羟基苯乙醇(99%,CAS:501-94-0)、对羟基苯甲醛(98%,CAS:123-08-0)、间苯二酚(99%,CAS:108-46-3)、对甲氧基苯酚(99%,CAS:150-76-5)、对羟基苯乙酸(99%,CAS:156-38-7)(上海麦克林生化科技股份有限公司);蜂蜜曲菌素(98%,CAS:480-33-1)、展青霉素(99%,CAS:149-29-1)(北京索莱宝科技有限公司);赭曲霉素A(99%,CAS:303-47-9,上海源叶生物科技有限公司)。
1.2 标准溶液制备
称取11种致病毒素标准品(2,5呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、展青霉素、对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸、对羟基苯甲酸、间苯二酚、对甲氧基苯酚、蜂蜜曲菌素、赭曲霉素A),准确称取0.005 g标准样品置于容量瓶中,用色谱级乙腈定容至25 mL,制备成200 mg/L的标准储备溶液,4 ℃冰箱中保存。使用时用色谱级甲醇逐级稀释成50.00、20.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.10和0.02 mg/L等浓度的标准溶液。
1.3 供试病菌及培养条件
选取本研究室苹果炭疽叶枯菌(Glomerella cingulata)菌株WT 030206、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)菌株LW03、苹果褐腐病菌(Monilinia fructigena)HF012。先采用PDA培养基(200 g马铃薯、20 g葡萄糖、10 g琼脂粉和1 L超纯水)对病菌进行活化与初培养,3种病菌分别培养5、3和3 d,使其菌落长至培养皿的三分之二。然后,直径5 mm打孔器在菌落边缘取菌饼,接种于装有150 mL Richard液体培养基(10 g KNO3、5 g K2HPO4、2.5 g MgSO4·7H2O、0.02 g FeSO4、50 g蔗糖、1 L去离子水)的玻璃锥形瓶(250 mL规格),每瓶接入15个直径为0.5 cm的菌饼,每种病菌培养3瓶,液体培养基使用前需121 ℃湿热灭菌20 min。接种后放置于生化培养摇床,温度和转速分别为25 ℃、180 r/min,黑暗条件下培养7 d。用4层纱布过滤掉培养液中的菌丝球,滤液置于4 ℃冰箱保存,等候检测。
1.4 样品前处理步骤
量取30.00 mL培养滤液转移至玻璃锥形瓶(100 mL规格)中,加入20.00 mL乙腈摇匀混合,然后100 W功率常温水浴超声萃取5 min。量取5.00 mL萃取液,放入离心机10000 r/min离心 20 min后,取其上清液加入2.0 g Na2SO4,使溶液过饱和、分层,驱使毒素物质离开水层(下层)进入乙腈层(上层)。摇匀分层后,吸取1.0 mL上层乙腈转移至离心管(2 mL规格)中。向离心管中加入20 mg C18净化剂,涡旋混匀1 min放入离心机,以10000 r/min、25 ℃的条件离心10 min。上清液采用0.22 μm针式过滤器过滤至棕色进样小瓶中,4 ℃保存等待进样。
1.5 HPLC分析条件
仪器采用岛津LC-2030D Plus高效液相色谱仪。流动相由含0.1%磷酸的超纯水(A)和甲醇(B)组成,采用梯度洗脱方式。梯度洗脱程序:0～15 min,5%B线性增加至20%;15～40 min,20%B线性增加至70%;40～45 min,70%B线性增加至85%;45～50 min,85%B线性增加至95%;50～55 min,95%B线性降低至85%;55～60 min,B保持5%;二极管阵列检测器(DAD)波长扫描范围:190～400 nm,11种物质的定量检测波长分别见表1,流速1.0 mL/min,色谱柱柱温30 ℃,进样量20 μL。
表1 11种毒素的保留时间、定量波长、线性回归方程、检出限、定量限、回收率及相对标准偏差注
Tab．1 Retention time,detection wavelength,linear regression equation,LOD,LOQ,recovery and RSD of 11 phytotoxins
Compound nameRetention timeDetection wavelengthLinear range,Regression equation,Coefficient regression (R2)LOD1) and LOQ2)Intra-day and Inter-day RSD(n=6)Recovery and RSD(n=5)BHMF11.447 min225 nm0.10～50.00 mg/L,y=103061x+7075.17,0.99990.02 mg/L,0.10 mg/L2.8%,4.5%89%,7.5%(0.10 mg/L);96%,3.2%(5.00 mg/L)HMF12.271 min280 nm0.25～50.00 mg/L,y=121994x+7766.90,0.98890.08 mg/L,0.25 mg/L3.2%,5.1%84%,9.2%(0.25 mg/L);94%,4.0%(5.00 mg/L)PAT13.278 min280 nm0.25～50.00 mg/L,y=118421x-11217.6,0.99590.08 mg/L,0.25 mg/L2.5%,4.2%92%,6.5%(0.25 mg/L);98%,2.8%(5.00 mg/L)
续表
Note:x:Compound concentration (mg/L);y:Corresponding peak area;1)S/N=3;2)S/N=10．
Compound nameRetention timeDetection wavelengthLinear range,Regression equation,Coefficient regression (R2)LOD1) and LOQ2)Intra-day and Inter-day RSD(n=6)Recovery and RSD(n=5)HBAld15.229 min225 nm0.10～50.00 mg/L,y=39628.1x+3096.16,0.99820.03 mg/L,0.10 mg/L3.5%,5.8%87%,7.8%(0.10 mg/L);95%,3.5%(5.00 mg/L)Tyrosol21.818 min225 nm0.10～50.00 mg/L,y=49721.7x+1128.96,0.98930.03 mg/L,0.10 mg/L4.2%,6.1%85%,9.5%(0.10 mg/L);93%,4.8%(5.00 mg/L)HPAA23.883 min225 nm0.10～50.00 mg/L,y=35550.7x+3091.54,0.98820.03 mg/L,0.10 mg/L3.0%,4.8%90%,6.8%(0.10 mg/L);96%,3.3%(5.00 mg/L)HBA24.530 min225 nm0.10～50.00 mg/L,y=36025.9x-8486.72,0.99920.03 mg/L,0.10 mg/L2.9%,4.6%91%,6.2%(0.10 mg/L);97%,2.6%(5.00 mg/L)Resorcinol25.786 min225 nm0.10-50.00 mg/L,y=89848.0x+28196.8,0.99810.02 mg/L,0.10 mg/L3.8%,6.2%86%,8.5%(0.10 mg/L);94%,4.2%(5.00 mg/L)Mequinol27.307 min225 nm0.10～50.00 mg/L,y=39502.5x+85.0345,0.99650.04 mg/L,0.10 mg/L2.6%,4.3%93%,5.8%(0.10 mg/L);99%,2.4%(5.00 mg/L)Mellein39.590 min247 nm0.15～50.00 mg/L,y=35223.7x+1505.75,0.99730.05 mg/L,0.15 mg/L3.5%,6.2%81%,11.2%(0.15 mg/L);90%,5.5%(5.00 mg/L)OTA46.933 min225 nm0.25～50.00 mg/L,y=81102.8x-8927.36,0.99890.08 mg/L,0.25 mg/L3.3%,5.4%85%,9.0%(0.25 mg/L);95%,3.8%(5.00 mg/L)
1.6 毒素鉴定方法
采用外标法进行毒素的定性鉴定与定量分析。将11种毒素物质的标准品混合梯度溶液与病菌发酵液样品同批次进样,所得数据采用岛津Labsolution工作站软件进行处理、分析,获得11种毒素的化合物紫外光谱特征(光谱曲线轮廓、特征吸收波长)、保留时间、标准工作曲线(表1)。
定性鉴定依据两个关键参数:(1)保留时间比对:样品色谱峰与标准品保留时间偏差在±0.20 min内视为匹配;(2)紫外光谱比对:样品色谱峰紫外光谱轮廓、特征吸收波长与标准品进行相似度评价,曲线轮廓相似、特征吸收波长偏差在±2 nm内视为匹配。通过以上双重参数匹配的色谱峰判定为相应的毒素。定量分析采用对应定量波长处的峰面积响应值,建立各毒素的标准工作曲线,定量计算发酵液中该毒素的含量,初步评估病菌的产毒素能力。
1.7 鉴定结果的质谱验证
为排除共流出物或结构相近物干扰,对经HPLC-DAD鉴定存在的3种物质蜂蜜曲菌素、2,5-呋喃二甲醇和对甲氧基苯酚,进行质谱定性验证。考虑理化性质、已有方法等因素,蜂蜜曲菌素采用UPLC-MS/MS方法,2,5-呋喃二甲醇和对甲氧基苯酚采用GC-MS方法。
将1.2制备的0.50和0.10 mg/L蜂蜜曲菌素标样溶液和1.4制备的苹果轮纹病发酵液样品的溶液放入Agilent 1290 UPLC-6460 MS/MS系统的自动进样器室,采用本研究组先前建立病菌发酵液中蜂蜜曲菌素的UPLC-MS/MS方法[13],进行仪器分析。数据采用Mass Hunter Qualitative Analysis软件进行数据处理,通过比对标样与发酵液样品MRM色谱峰的保留时间,进行定性确证。
将50.00 mg/L 2,5-呋喃二甲醇和10.00 mg/L对甲氧基苯酚标样溶液和苹果炭疽叶枯菌、苹果褐腐病菌发酵液样品,用氮吹仪除去溶剂。借助Thermo TSQ 8000 Evo气质联用仪,采用研究组先前建立的病菌发酵液中化合物的GC-MS验证方法[16],进行样品的衍生化和GC-MS分析。数据采用赛默飞Xcalibur工作站软件进行处理,通过比对标样与发酵液样品TIC色谱峰的保留时间、EI质谱图,进行定性验证。
1.8 数据统计分析方法
使用GraphPad Prism等软件,进行数据预处理、计算,结果表示为平均值±标准偏差(Mean±SD)。
2 结果与讨论
2.1 前处理条件优化
为了加快样品萃取效率、简化程序,参照QuEChERS前处理优化步骤[19],对样品前处理步骤进行了优化。综合考虑提取效率与操作便捷性,本研究选择超声5 min作为最佳萃取时间。考虑到病菌培养液的特点,采用盐析萃取、吸附剂净化的策略,以Richard液体培养基中添加1 mg/L毒素的回收率(检测到的峰面积与1 mg/L标样峰面积之比的百分率)作为评价指标进行了优化。盐析剂种类与添加量是决定培养液水相-乙腈相分层效果、目标毒素萃取回收率的重要因素。首先考察了盐析剂Na2SO4、(NH4)2SO4和NaCl不同使用量(1.0、2.0、2.5、3.0 g,添加到5.00 mL待萃取培养液)对盐析分层和添加回收率的影响,发现:2.0 g添加量条件下,3种盐析剂均能达到过饱和状态、盐析出,其中Na2SO4、(NH4)2SO4的分层效果较好,可快速形成清晰的乙腈-水分层,有利于分层取样;2.0 g添加量的条件下,使用Na2SO4时11种毒素的添加回收率均较高(范围95%～98%),回收率优于(NH4)2SO4使用组(图1)。因此,选择2.0 g Na2SO4作为前处理方法的盐析剂。此条件下11种毒素物质可被Na2SO4最大限度地驱赶进入上层乙腈,有利于化合物富集、极性杂质去除。
数据表示为3次重复的平均值±标准偏差
图1 盐析试剂及净化剂不同用量对11种毒素加标回收率的影响
Fig．1 Effects of different amounts of salt-out and purifying reagents on the recoveries of 11 spiked phytotoxins
盐析剂确定后,以炭疽叶枯菌培养液为代表,考察了净化剂(PSA、C18和Florisil)的不同添加量(10、20、30、40 mg,添加到1.00 mL待净化乙腈层)及GCB(5、10、20 mg,添加到1.00 mL待净化乙腈层)对盐析乙腈层的净化效果和回收率的影响。结果表明,PSA、C18、Florisil和GCB处理均可使炭疽叶枯菌发酵液由深黄色变浅,GCB作为净化剂时的变化最大,显示4种净化剂均可吸附去除发酵液中的色素,减少基质对目标化合物的干扰;但同时,PSA、C18、Florisil和GCB处理均造成回收率显著下降,表明吸附剂可同时吸附11种毒素化合物,其用量对方法准确度的影响较大;其中,GCB的影响最大,用量≥5 mg时部分毒素的回收率为41%～66%,而C18对回收率的负面影响最小,用量≤20 mg时毒素平均回收率为90%～99%(图1)。GCB对芳香族、共轭结构化合物具有极强的广谱吸附性,而11种毒素多含有共轭结构,因此GCB使用会造成回收率显著降低。PSA主要针对极性杂质、有机酸进行吸附,Florisil对中极性杂质吸附能力较强,但二者对目标毒素仍存在非特异性吸附。C18为非极性吸附剂,在20 mg用量下,既能实现降低基质干扰,又可使回收率保持理想范围。基于以上结果,综合考虑净化效果及加标回收率,最终选择20 mg C18作为前处理方法的样品净化剂。
2.2 仪器分析参数优化
对色谱分离条件进行了优化,以实现发酵液中多种毒素的分离。考虑到目标毒素多为有机酸、酚类、呋喃衍生物等极性较强的化合物,酸性流动相的加入可抑制酸性物质解离、增强保留行为的重现性。经预实验比较,水相中同等添加量(0.1%)条件下,磷酸的效果优于甲酸和乙酸,因此选择含0.1%色谱级磷酸的超纯水作为水流动相(A)。磷酸属于中强酸,缓冲能力更强、质子化效果更稳定,能有效改善峰形对称性。甲醇对中等极性至弱极性化合物具有良好的溶解性与洗脱能力,因而选择色谱甲醇作为有机流动相(B)。为实现11种毒素的分离并缩短分析时间,确保不同极性范围的毒素均能获得适宜的保留时间与分离度,通过多次摸索性的试验,得到的最佳洗脱程序为:0～15 min,5% B线性增加至20%,此阶段主要用于分离强极性早期出峰物质;15～40 min,20% B线性增加至70%,为关键分离区间,涵盖大部分中等极性毒素;40～45 min,70% B线性增加至85%,45～50 min,85% B线性增加至95%,用于洗脱弱极性组分;50～55 min,95% B线性降低至85%,55～60 min,B保持5%,实现色谱柱的再平衡。梯度程序在保证目标毒素有效分离、出峰的前提下,适配病原菌发酵液多组分同步检测的需求。
最佳分离条件下,11种毒素的标样、Richard发酵液空白样品及3种苹果病原菌发酵液样品的色谱图如图2所示。由曲线(1)可知,2,5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、展青霉素、对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸、对羟基苯甲酸、间苯二酚、对甲氧基苯酚、蜂蜜曲菌素和赭曲霉素A的出峰时间分别为11.447、12.271、13.278、15.229、21.818、23.883、24.530、25.786、27.307、39.590和46.933 min,分离度较好,可用于不同毒素的初步定性鉴定。值得注意的是,曲线(1)中两组邻近峰:峰2和3、峰6和7未实现完全的基线分离,但分析验证显示,两者不互相影响邻近峰的峰识别和外标法定量。后续可继续对色谱分离条件如流动相、梯度进行优化,减少总分离时间,提高邻近峰物质的分离度。由曲线(2)可知,Richard发酵液空白由于基础背景简单(蔗糖和无机盐),色谱图中的杂质峰(0～4 min)与11种毒素均无重合,因此Richard培养基成分不影响11种毒素物质的分离与鉴定。
峰:1． 2,5-呋喃二甲醇,11.447 min;2． 5-羟甲基糠醛,12.271 min;3．展青霉素,13.278 min;4．对羟基苯甲醛,15.229 min;5．对羟基苯乙醇,21.818 min;6．对羟基苯乙酸,23.883 min;7．对羟基苯甲酸,24.530 min;8．间苯二酚,25.786 min;9．对甲氧基苯酚,27.307 min;10．蜂蜜曲菌素,39.590 min;11．赭曲霉素A,46.933 min。5个色谱图均为225 nm波长处的图谱。10 mg/L标样(1)、空白Richard培养液(2)、苹果炭疽叶枯菌培养液(3)、苹果轮纹病菌培养液(4)和苹果褐腐病菌培养液(5)
图2 11种毒素的HPLC色谱图
Fig．2 HPLC chromatograms of 11 phytotoxins
借助DAD检测器的全波长扫描功能,对11种毒素的紫外光谱进行了扫描,光谱曲线轮廓及特征吸收峰波长如图3所示。由图可知,各毒素的紫外光谱曲线轮廓、特征吸收波长(最大吸收峰)均不完全相同,且同等浓度条件下峰强度也不一样,表明每种化合物均有自己的特征波长,可作为化合物的重要特征,与保留时间一起作为毒素定性鉴定的重要依据。比如,2,5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛均为呋喃衍生物,但光谱曲线轮廓差异较大、吸收峰波长也不同,两者分别为223和283 nm,有利于两种物质的定性鉴别。同时,酚类毒素如对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸等的光谱具有一定的相似性,为减少化合物定量中的波长转换、稳定基线,可采用同一定量波长(225 nm)。5-羟甲基糠醛和展青霉素虽结构有差异,但光谱特征相似,采用同一定量波长(280 nm)。蜂蜜曲菌素与其他化合物均有差异,定量波长采用247 nm。差异化定量波长的匹配,保留了特征化合物的检测灵敏度,兼顾了同类化合物的检测稳定性,为病原菌发酵液中毒素的定量分析提供了方法支撑。综合考虑以上因素,11种毒素鉴定的化合物参考保留时间、标准工作曲线与定量波长等如表1所示。
a．1． 2,5-呋喃二甲醇;2． 5-羟甲基糠醛;3．展青霉素;b． 4．对羟基苯甲醛;5．对羟基苯乙醇;6．对羟基苯乙酸;c．7．对羟基苯甲酸;8．间苯二酚;9．对甲氧基苯酚;d．10．蜂蜜曲菌素;11．赭曲霉素A
图3 11种毒素标样的紫外光谱图
Fig．3 UV spectrum of 11 phytotoxin standards
2.3 方法学验证
方法学验证是评价色谱检测体系准确性、稳定性与实用性的核心依据。为验证所建立的高效液相色谱分析方法的可靠性,参照色谱分析方法验证要求[20],评价了方法的线性范围、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度、重复性及添加回收率等重要指标。
2.3.1 方法的工作曲线和灵敏度
方法线性关系与灵敏度是保障化合物定量的基础条件。采用外标法定量方法,在空白Richard发酵液中添加毒素混合标准溶液,以各毒素峰面积响应值(y)对其质量浓度(x,mg/L)绘制标准工作曲线。结果(表1)表明,11种毒素在LOQ到50 mg/L的浓度范围内均呈现良好的线性关系,线性回归方程的相关系数(R2)均大于0.988,表现出较好的线性响应。以信噪比(S/N)=3时的最低进样浓度作为检出限(LOD),以S/N≥10时且回收率符合分析方法要求的浓度作为定量限(LOQ)。由表1可知,11种毒素的LOD均≤0.08 mg/L;2,5-呋喃二甲醇、对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸、对羟基苯甲酸、间苯二酚及对甲氧基苯酚的LOQ为0.10 mg/L,展青霉素、5-羟甲基糠醛及赭曲霉素A的LOQ为0.25 mg/L,蜂蜜曲菌素的LOD为LOQ为0.15 mg/L。
2.3.2 精密度与重复性
以日内相对标准偏差(Intra-day RSD)评价方法的精密度,以日间相对标准偏差(Inter-day RSD)评价方法的重复性。取1.00 mg/L浓度水平的混合标准溶液,日内平行测定6次,连续3日每日平行测定6次(n=6)。结果(表1)显示,11种毒素的日内RSD为2.5%～4.2%,日间RSD为4.2%～6.2%,均小于7.0%,符合色谱分析方法学验证中RSD<15%的要求。因此,方法具有较好的精密度和重复性。
2.3.3 方法的添加回收率
以Richard液体培养基空白为基质,添加低(0.1 mg/L)和高(5.00 mg/L)两个含量水平的混合毒素标准溶液,每个水平重复5次,按1.4所述的前处理方法进行样品前处理,计算添加回收率及相对标准偏差。结果(表1)表明,11种毒素的添加回收率范围为81%～99%,RSD为2.4%～11.2%,符合色谱分析方法对回收率的要求。
基于以上结果,建立的HPLC分析方法在灵敏度、线性、回收率、精密度等方面满足病原菌发酵液中11种毒素的鉴定需求,前处理操作简便,适用于常规实验室批量病菌发酵液的样品筛查。
2.4 实际样品中毒素的靶向鉴定
将建立的方法用于3种病原菌(苹果炭疽叶枯菌G．cingulata、苹果轮纹病菌B．dothidea、苹果褐腐病菌M．fructigena)发酵液中11种致病毒素的快速鉴定,结果见图2曲线(3)、(4)、(5)及表2。结果表明:(1)苹果炭疽叶枯菌发酵液中存在与2,5-呋喃二甲醇保留时间相近的峰,实际保留时间11.409 min,与参考保留时间误差-0.038 min,光谱曲线轮廓相似、特征吸收峰波长相同,因而判断炭疽叶枯菌能分泌产生2,5-呋喃二甲醇(BHMF);定量分析显示其在发酵液中的含量为(1.55±0.24) mg/L;(2)苹果轮纹病菌发酵液中存在与蜂蜜曲菌素保留时间相近的峰,实际保留时间39.498 min,与参考保留时间误差 -0.122 min,光谱曲线轮廓相似、特征吸收峰波长相同,因而判断轮纹病菌能分泌产生蜂蜜曲菌素(mellein);定量分析显示其含量为(3.28±0.41) mg/L;(3)苹果褐腐病菌发酵液中存在与对甲氧基苯酚保留时间相近的峰,实际保留时间27.363 min,与参考保留时间误差+0.056 min,光谱曲线轮廓相似、特征吸收峰波长相同,因而判断褐腐病菌能分泌产生对甲氧基苯酚(mequinol);定量分析显示其含量为(1.87±0.15) mg/L。
表2 3种病菌培养液中致病毒素的靶向鉴定结果
Tab．2 Results of target identification of phytotoxins in the culture fluid of three fungi
CompoundPathogenRetention time/minCharacteristic UV wavelength/nmConcentration/(mg·L-1)BHMFGlomerella cingulata11.409223,2691.55±0.24MequinolMonilinia fructigena27.363222,2881.87±0.15MelleinBotryosphaeria dothidea39.498247,3133.28±0.41
2.5 鉴定结果的质谱验证
HPLC-DAD在化合物定性上具有一定的局限性,为排除可能的共流出物和结构相近物的干扰,按照1.7所述方法,分别进行了苹果炭疽叶枯菌(G．cingulata)、苹果轮纹病菌(B．dothidea)和苹果褐腐病菌(M．fructigena)发酵液中2,5-呋喃二甲醇(BHMF)、蜂蜜曲菌素(mellein)和对甲氧基苯酚(mequinol)的质谱验证,结果见图4。UPLC-MS/MS验证结果(图4a)显示,多反应监测模式条件下,B．dothidea发酵液中含有mellein峰(m/z 179.0>161.0)。GC-MS验证结果表明:(1)G．cingulata发酵液中含有BHMF峰,保留时间相近,EI质谱主要碎片相同(图4b);(2)M．fructigena发酵液中含有mequinol峰,保留时间相近,EI质谱主要碎片相同(图4c)。以上验证结果表明,HPLC-DAD鉴定的定性结果比较准确、可靠,可为病原菌发酵液中11种毒素的快速筛查提供方法支撑。
a．左、右分别为蜂蜜曲菌素标样和发酵液样品的LC-MS色谱图;b．左为2,5-呋喃二甲醇标样与发酵液样品的GC-MS色谱对比图,右为标样与样品的质谱对比图;c．左为对甲氧基苯酚标样与发酵液样品的GC-MS色谱对比图,右为标样与样品的质谱对比图
图4 病菌发酵液中蜂蜜曲菌素(a)的UPLC-MS/MS验证及2,5-呋喃二甲醇(b)、对甲氧基苯酚(c)的GC-MS验证
Fig．4 UPLC-MS/MS validation of mellein (a) and GC-MS validation of BHMF (b) and mequinol (c) in the pathogen culture
3 结论
以Richard液体培养基为发酵基质,采用超声辅助乙腈萃取、Na2SO4盐析分层与C18吸附剂净化的前处理策略,基于保留时间与紫外光谱双重匹配策略,建立了同时快速鉴定植物病原菌培养液中11种致病毒素(2,5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、展青霉素、对羟基苯甲醛、对羟基苯乙醇、对羟基苯乙酸、对羟基苯甲酸、间苯二酚、对甲氧基苯酚、蜂蜜曲菌素和赭曲霉素A)的HPLC-DAD分析鉴定方法。11种毒素在0.10～50.00 mg/L浓度范围内线性关系良好,灵敏度、精密度和加标回收率等指标均满足色谱分析方法要求。
将建立的方法应用于苹果炭疽叶枯菌、苹果轮纹病菌和苹果褐腐病菌发酵液中11种毒素的HPLC-DAD靶向鉴定,结果显示3种病原菌可分别产生2,5-呋喃二甲醇、蜂蜜曲菌素和对甲氧基苯酚。基于UPLC-MS/MS和GC-MS方法的质谱验证结果分别确认了苹果炭疽叶枯菌、苹果轮纹病菌和苹果褐腐病菌发酵液中含有2,5-呋喃二甲醇、蜂蜜曲菌素和对甲氧基苯酚。本研究建立的鉴定方法,无需复杂的分离纯化与结构鉴定步骤,适用于批量病菌发酵液中11种毒素的快速筛查,为植物病原菌毒素的相关研究提供了一种实用的分析检测工具。
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