基于气相色谱质谱研究肺癌呼气特征性挥发有机化合物

据WHO统计,仅2020年全球就有220万新发肺癌患者,约占所有新发癌症患者的11.4%,肺癌新发死亡人数约180万,约占所有癌症患者的18%[1]。约85%的肺癌患者被确诊时已为晚期,其5年存活率仅为3.5%[2,3]。目前,常规的肺癌检测技术包括计算机断层扫描(CT)、胸部X射线(CXR)、痰细胞学检查、低剂量CT (LDCT)和活检。然而,这些方法存在入侵性、假阳性高和辐射暴露风险等缺点[4-6]。因此寻找一种快速、非侵入、无辐射且经济有效的早期肺癌检测技术迫在眉睫。

近年来,呼气诊断由于其无创性、样品易得、患者可接受程度高和灵敏度高等优点,在肺癌及肺部炎症患者领域的应用备受关注。气相色谱-质谱联用法(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)作为传统的挥发性有机物(Volatile organic compounds,VOCs)分析方法在呼气VOCs标志物筛查领域的应用也日益拓展。早在1985年,Gordon等[7]首次采用气相色谱-质谱法对肺癌患者呼气中VOCs进行了检测分析,引发了人们对呼气VOCs用于肺癌诊断的探索。谢少华等[8]应用GC-MS研究了呼出气VOCs对50岁以下人群患良/恶性肺结节的预测价值,发现环戊烷、3-甲基戊烷和乙苯可以作为区分肺结节良/恶性的特征性VOCs。Zou等[9]研究发现将机器算法和呼气分析相结合,置信样本区分肺癌患者和健康志愿者的准确率可达93%。茹立华等[10]应用TD-GC-MS探究79名肺癌患者和101名健康志愿者,检测到10种特征性VOCs,其模型准确率为96.25%。然而,肺癌呼气特征性VOCs的分析和筛查与样本量大小和实验队列设计等因素密切相关,先前的研究大多单纯地将健康对照和肺癌患者进行了比较[9,11-13],缺乏肺癌与其他癌症特征性VOCs的筛选和对比,可能导致一些特征性VOCs出现假阳性的结果。

基于此,本研究将应用热脱附-气相色谱-质谱联用法(TD-GC-MS)对肺癌患者的呼气VOCs进行定性定量分析,并通过与乳腺癌患者和健康对照组呼气VOCs比较,运用统计学的方法研究肺癌患者呼气VOCs与乳腺癌患者及健康人群的呼气VOCs的差异性,筛查肺癌患者的呼气特征性VOCs,运用机器学习模型决策树(DT)、逻辑回归(LR)、支持向量(SVM)和朴素贝叶斯(NB)验证这些特征性VOCs的准确性并探究其来源和代谢途径,为呼气诊断运用于肺癌提供新的思路和方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

BPG-9070A型鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);QP2020 NX型GC-MS分析仪(岛津企业管理有限公司);U-KORI-XR型热脱附仪(英国Markes国际有限公司);1 L Tedlar袋(大连德霖有限公司)。

高纯氮气、高纯氦气(99.999%、河南迎众化工产品有限公司)。

1.2 研究对象与分组

本研究于2021年11月至2023年7月在河南中医药大学和河南中医药大学第三附属医院肿瘤科进行,共采集呼气样本360例,其中肺癌患者176例,乳腺癌患者50例,健康人群134例,其人口统计学特征如表1所示,受试者在采集样品前签署受试者信息调查表和知情同意书。肺癌患者入组标准:经病理学或支气管镜检查确诊为肺癌患者,年龄>18岁,排除患有其他肿瘤、慢性呼吸道疾病,不能配合呼气采集或者在任何阶段要求终止实验的患者。乳腺癌患者入组标准:经穿刺或活检证实为乳腺癌患者,没有肺部转移,年龄>18岁,排除标准如肺癌。健康对照组没有任何肺部和乳腺疾病。

1.3 呼气样品采集

呼出气体采集在固定的房间进行,为排除食物等外源性污染,受试者在采样前遵循以下原则:

(1)采样前8 h禁烟禁酒禁食且采样时空腹,不刷牙,不涂抹化妆品。

(2)采样开始前漱口,采样时平静呼气 15 min,排除因剧烈活动引起的异戊二烯升高[14],深呼吸3次后憋气10 s(鼻吸口呼),最后通过一次性吹嘴将气体吹入1 L Tedlar袋中,如吹不满重复上述操作,直至吹满为止。

(3)每个参与者采集3个平行样,为了排除环境的干扰,同时采集环境样作为背景气。

呼出气体采集完成后对样品编号,将样品保存在4 ℃恒温保温箱避光保存,在2 h内运回实验室,24 h内完成分析。

1.4 呼气检测

使用GC-MS,所用色谱柱包括DB-1(60.0 m×0.25 mm×1 μm)和Rt-Alumina BOND/Na2SO4(30.0 m×0.32 mm×5 μm),同时搭载中心切割系统,能将C2和C3物质更好的分离。采集的呼出气经热脱附预浓缩后进行检测。GC-MS的分析条件如表2所示。

1.5 数据分析

采用GC-MS solution对呼气样本中的VOCs进行定性和定量,对360个呼气样本进行Mann-Whitney检验(U检验)以及正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析,选定P<0.05以及变量投影重要值(Variable influence in projection,VIP)≥1.5的VOCs为特征性VOCs,将呼气样本中选定的特征性VOCs划分为60%的训练集和40%的验证集,构建不同的机器学习模型,分析其准确度、精准度、灵敏度和特异性,进一步验证特征性VOCs对肺癌的诊断性能。根据京都基因与基因组百科全书(KEGG,http://www．genome．jp/kegg/)数据库对代谢物进行定性评估,对P<0.05的物质进行代谢途径KEGG富集分析,探究呼出气体潜在的代谢途径。

2 结果与讨论

2.1 呼出气体中特征性VOCs

将采集到的肺癌患者、乳腺癌患者和健康对照组的呼出气体VOCs进行GC-MS分析,依据差异倍数log2FC>1且P<0.05,将检测到的VOCs绘制火山图,如图1所示。从图中可以看出,部分VOCs在肺癌患者、乳腺癌和健康人群中分别呈现不同上调和下调趋势,说明VOCs在不同的癌症患者和健康人群中有一定的差异。

2.1.1 健康对照组、肺癌患者和乳腺癌患者呼出气体中特征性VOCs

OPLS-DA是一种有监督的判别分析方法,在降维的同时考虑了分组信息,目前广泛用于特征选择及分类[15]。本研究将测得的健康对照组、肺癌患和乳腺癌患者的VOCs浓度信息建立OPLS-DA模型,如图2所示。从图2a可以看出,健康人群、肺癌患者和乳腺癌患者的呼气VOCs存在显著差异,组内聚集性良好,在95%的置信区间内组间差异明显。此外,如图2b所示,模型中R2和Q2分别为0.880和0.930,表明模型拟合的主成分有良好的解释能力,同时预测的准确率高达93%。为了防止OPLS-DA模型出现过拟合,本研究进行了200次交叉置换检验验证,发现R2和Q2均低于原始数据,如图2c所示,说明模型不存在过拟合且具有良好的稳定性和可靠性。因此基于OPLS-DA分类,健康人群、肺癌患者和乳腺癌患者可以进行区分。

2.1.2 肺癌患者呼出气体中特征性VOCs

为进一步探究肺癌患者呼气中的特征性VOCs,将测得的健康对照组和肺癌患者的VOCs浓度建立OPLS-DA模型,如图3所示。从图3a可以看出,肺癌患者和健康人群的呼气VOCs存在显著差异,组内聚集性良好,在95%的置信区间内组间差异明显。此外,如图3b所示,模型中R2和Q2分别为0.870和0.863,表明模型拟合的主成分有良好的解释能力,同时预测的准确率高达86.3%。为了防止OPLS-DA模型出现过拟合,本研究进行了200次交叉置换检验验证,发现R2和Q2均低于原始数据,如图3c所示,说明模型不存在过拟合且具有良好的稳定性和可靠性。基于OPLS-DA分类,进一步的,将模型贡献较大的变量信息以VIP值来衡量。如图3d和表3所示,当VIP≥1.5时,共筛选出8种存在显著差异的VOCs (P<0.05)。因此,顺式-2-丁烯、苯、1,2-二氯丙烷、三氯乙烯、4-甲基-2-戊酮、3-甲基戊烷、正辛烷和萘可作为肺癌的特征性VOCs。特征性VOCs的浓度变化箱式图具体如图4所示,其中苯、萘、三氯乙烯和正辛烷的浓度在肺癌患者中表现为下降,顺式-2-丁烯、1,2-二氯丙烷、4-甲基-2-戊酮和3-甲基戊烷的浓度在肺癌患者中表现为上升。

2.1.3 乳腺癌患者呼出气体VOCs特征

从图5a可以看出,乳腺癌和健康人群呼气样本存在显著差异,在95%的置信区间内组间差异明显,组内聚集性良好。此外,如图5b所示,模型中R2和Q2分为0.910和0.864,表明模型拟合的主成分有良好的解释能力,同时预测的准确率高达86.4%。图5c给出了200次交叉置换检验验证图,发现R2和Q2均低于原始数据,说明OPLS-DA模型不存在过拟合且具有良好的稳定性和可靠性。对于乳腺癌患者和健康对照组,基于OPLS-DA模型对贡献相对较大的变量信息以VIP值来衡量。如图5d和表4所示,当VIP≥1.5时,共发现8种具有显著差异的VOCs(P<0.05)。依据建立的OPLS-DA模型,乙烯、正丁醛、1-己烯、三氯甲烷、苯、戊醛、4-甲基-2-戊酮和正辛烷可作为乳腺癌的特征性VOCs,其中4-甲基-2-戊酮、正辛烷和苯同时在肺癌患者和乳腺癌患者中被发现,这3种VOCs有可能是肺癌和乳腺癌共有的标志物,其中4-甲基-2-戊酮在乳腺癌患者中同样表现为浓度上升,而正辛烷和苯的浓度在乳腺癌患者中也表现为下降。

2.1.4 与乳腺癌患者比较,肺癌患者呼出气体VOCs特征

为了探究不同疾病中呼气特征性VOCs的不同,将乳腺癌患者呼气VOCs作为疾病对照组,与肺癌患者的呼气VOCs进行比较,如图6a所示。从图中可以看出,乳腺癌患者和肺癌患者的呼气VOCs存在显著差异,在95%的置信区间内组间差异明显,组内聚集性良好。此外,如图6b所示,模型中R2和Q2为0.921和0.832,表明模型拟合的主成分有良好的解释能力,同时预测的准确率高达83.2%。此外,根据200次交叉置换检验(图6c),R2和Q2均低于原始数据,说明模型不存在过拟合且具有良好的稳定性和可靠性。当VIP值≥1.5时,共筛选出10种存在显著性差异的VOCs(P<0.05),如图6d和表5所示。依据建立的OPLS-DA模型,顺式-2-丁烯、乙烯、丙烷、1-戊烯、1-己烯、2,3,4-三甲基戊烷、正辛烷、间对二甲苯和邻二甲苯在肺癌患者与乳腺癌患者中有较大差异。其中正辛烷同时在肺癌和乳腺癌患者中被发现,可能是两种癌症共同的特征性VOCs,但在肺癌和乳腺癌患者中的浓度差异不同,虽然在乳腺癌患者和肺癌患者中浓度均下降,但肺癌患者呼气中的浓度仍要高于乳腺癌患者。

2.2 肺癌特征VOCs的相关信息

为进一了解8种特征性VOCs对肺癌的诊断能力,计算肺癌患者筛选出的8种特征VOCs曲线下面积(Area under the curve,AUC)及其联合诊断能力,具体信息如表3和图7所示。从表3可以看出,每一种特征性VOCs的P值均小于0.001,在肺癌患者和健康人群中表现出显著的差异性,其AUC均在0.7～0.85之间,表现出适中的诊断价值。如图7所示,2种特征性VOCs联合应用时其AUC为0.929,随着特征VOCs的增加,AUC随之变大,当8种特征VOCs联合应用时其AUC高达0.981,且95%置信区间(CI)为0.952～0.994,表现出了良好的诊断价值。

2.3 机器学习模型的建立与评估

随着人工智能的发展,越来越多的机器学习算法在医药行业运用[16,17],本研究基于肺癌患者和健康人群310个呼气样本的OPLS-DA模型选出的8种VOCs为自变量,运用6折交叉验证以 6∶4构建训练集和测试集(将训练集和测试集多次划分),建立4种常见的机器学习模型:决策树(DT)算法、逻辑回归(LR)算法、支持向量(SVM)算法和朴素贝叶斯(NB)算法。为防止模型出现过拟合,每种算法至少建模10次以上,发现每次结果相当,证明未出现过拟合。如表6所示,以60%的样本进行训练时,4种机器学习模型的准率、精准度、灵敏度和特异性均高于89%,其中SVM的诊断能力最佳,其准确率高达96.28%,F1分数为96.08%。模型中的准确度、精准度、灵敏度(召回率)、特异性和F1分数是按照下面公式计算。

其中TP、FP、TN和FN分别为真阳性、假阳性、真阴性和假阴性。为验证已建立的机器学习模型,以剩余40%样本为测试集,对受试者是否为癌症患者进行验证,其结果如表7所示,建立的4种机器学习模型的准确度、精准度、灵敏度和特异性均高于87%,且SVM模型的诊断能力最为突出,其准确度高达95.41%,F1分数为94.51%,因此基于8种潜在肺癌标志物的SVM机器学习模型在实现肺癌的正确分类中表现出了巨大的潜力。

2.4 特征VOCs的代谢途径

为进一步探究特征VOCs的来源与代谢途径,将肺癌患者呼气中具有显著差异的VOCs(P<0.05)导入最新的差异代谢物KEGG数据库进行通路分析,发现15条代谢通路,如图8和表8所示。其中 P<0.05且矫正后的P值FDR (False discovery rate)小于0.05的通路有4条,如甲苯和二甲苯的降解、四氯乙烯的降解、萘和蒽的降解、细胞色素p450对外源性药物的代谢作。

本研究中发现直链烷烃类化合物辛烷在肺癌患者中浓度下降,支链烷烃类化合物2,3,4-三甲基戊烷在肺癌患者中的浓度升高,它们的产生主要是由于多聚不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的过氧化作用。脂质过氧化是机体损伤的主要原因,可能是癌症、炎症疾病、衰老的主要原因[18-20]。

研究表明戊醛可以用于区分肺癌患者和健康人群,且在肺癌患者体内浓度升高[19],醛主要是细胞色素p450对过氧化氢的还原生成,p450是脂质过氧化的次级代谢物,因此肺癌患者体内肿瘤组织氧化活性增强会导致醛含量升高。4-甲基-2-戊酮作为肺癌的标志物[20],在肺癌患者中浓度升高已经被证实,在体内没有代谢的碳氢化合物会在几分钟内释放到呼吸中[21]。酮类主要通过细胞色素p450对脂质过氧化的β-裂解反应产生,在恶病质状态(如癌症等疾病)下,蛋白质代谢会增加,导致酮体水平升高[22]。

在本研究中发现了细胞色素p450对外源性药物的代谢作用,细胞色素p450在内源性和外源性物质尤其是药物的代谢中发挥重要作用。越来越多的流行病学、诊断和临床报告表明p450在癌症的形成、预防和转移中发挥重要作用[23]。其代谢途径主要涉及的化合物有萘和三氯乙烯,两者均被选为潜在肺癌标志物,目前虽然没有证据能够证明萘和三氯乙烯与肺癌的关,但是二者均被国际癌症研究机构(IARC)评定为可能致癌物,且三氯乙烯在小鼠毒性试验中能够引起肺纤维化[24]。萘主要来源于汽车尾气和香烟中[24],存在一定的毒性作用,有研究发现其在肺癌和健康人群中存在显著差异[25]。同时还发现了四氯乙烯的降解途径,四氯乙烯与三氯乙烯结构相似,表现出相似的毒性作用[26]。与Zou等[27]的研究一致,同样发现了甲苯和二甲苯的降解,这类代谢途径主要涉及芳香类化合物,本研究中发现了苯、苯甲醛和邻二甲苯,虽然目前没有发现任何文献报道这一途径和肺癌发病率的关系,但是苯[18,28]、甲苯[9,18,29]、二甲苯[18]、苯甲醛[12]确实是肺癌的危险因素,它们也在呼出气体中被检测,被报道作为肺癌的潜在标志物。但这类物质通常被认为是外源性污染物,Koureas等[18]通过对肺癌患者、良性肺部疾病患者和健康志愿者呼气中的VOCs进行靶向分析,发现与健康对照组相比,乙苯、苯乙烯、甲苯、二甲苯在肺癌患者的呼气中浓度水平显著升高,其作为肺癌标志物受到了质疑,因此需要进一步研究。

3 结论

本研究基于TD-GC-MS对176名肺癌患者,50名乳腺癌患者和134名健康人群的呼出气体进行研究。通过OPLS-DA模型发现有10种VOCs可以区分肺癌和乳腺癌,有8种VOCs可以区分肺癌患者健康人群,其中有3种VOCs,即4-甲基-2-戊酮、正辛烷和苯同时出现在肺癌和乳腺癌患者中,可能是两种癌症共同的特征性VOCs,有5种VOCs为肺癌独有的化合物包括:顺式-2-丁烯、戊醛、三氯乙烯、2,3,4-三甲基戊烷和萘。此外,基于肺癌患者呼气中发现的8种特征性VOCs建立了SVM的机器学习模型,其准确度、精准度、灵敏度和特异性分别达到95.41%、95.15%、93.99%和96.67%。本研究建立了一种呼气VOCs用于无创诊断肺癌的方法,同时联合代谢数据库,解释了这些VOCs可能的来源和代谢途径,为呼气用于肺癌的诊断提供了一些新的思路和方法。在未来的研究工作中,我们将进一步细化肺癌分期,增加样本量,提高肺癌呼气特异性VOCs筛查的准确性。

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