氯乙基亚硝基脲(Chloroethylnitrosoureas,CENUs)是重要的烷化剂类抗肿瘤药物,其化学结构是由N-甲基-N-亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)的N2位被氯乙基取代所形成,其中卡莫司汀(Carmustine,BCNU),分子结构如图1所示,为其典型代表[1],广泛用于治疗脑部恶性肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等多种恶性肿瘤[2]。BCNU通过烷基化鸟嘌呤碱基的O6位点,与互补链上的胞嘧啶发生共价连接,形成DNA链间交联(Interstrand crosslinks,ICLs),从而发挥其抗肿瘤作用。DNA ICLs可阻碍DNA的复制与转录过程中双链的分离,抑制肿瘤细胞生长甚至诱导其死亡[3-5]。然而,DNA损伤修复酶O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase,AGT)能够修复BCNU引发的烷基化损伤,介导肿瘤耐药性,成为化疗失败的关键因素之一[6-8]。因此,开发克服耐药性的新策略具有重要意义。O6-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,O6-BG)作为首个进入临床试验的AGT抑制剂,可高效灭活AGT,显著增强肿瘤细胞对O6位烷基化药物的敏感性[9,10]。然而,BCNU与O6-BG均缺乏靶向特异性,可无差别作用于肿瘤与正常组织,存在诱发继发性肿瘤的风险。实现抗癌药物在肿瘤组织的靶向富集,是提高疗效与安全性的关键。
图1 BCNU和FCAB偶联物的分子结构
Fig．1 Molecular structure of BCNU and FCAB conjugate
近年来,随着纳米技术的迅猛发展,在生物医药领域的应用日益广泛[11]。纳米粒子表现出优异的物理和化学特性,能够高效负载多种抗肿瘤药物,包括传统的小分子化疗药物、基因治疗载体和蛋白质类药物等大分子活性物质[12]。壳聚糖(Chitosan,CS)作为一种天然阳离子多糖,主要来源于海洋甲壳类生物,因其良好的生物相容性、可降解性、低毒性、亲水性及易修饰性,被广泛认为是理想的纳米药物递送载体[13]。Hafizi等[14]采用离子交联法制备了负载万古霉素的壳聚糖纳米粒,该纳米载体具有良好的药物缓释性能,在 100 h内可持续释放药物,展现了其在抗菌治疗中的应用潜力。Revathi等[15]从虾壳中提取壳聚糖制备纳米粒,并负载复方草药用于糖尿病治疗,该纳米药物在降血糖及改善糖尿病并发症方面表现出理想的疗效。Jin等[16]设计开发了负载姜黄素或尼达尼布的壳聚糖纳米载体用于靶向肺部递送,该纳米药物可显著改善肺纤维化大鼠的肺功能,降低炎症因子水平并减轻肺部病理损伤,展现出良好的抗纤维化效果。
尽管壳聚糖载体在上述应用中表现出良好潜力,传统CS载体仍面临一些关键挑战,包括靶向能力有限、难以主动克服多重耐药机制等问题[17,18]。研究表明,通过对壳聚糖进行合理功能化修饰,可显著提升其性能。Islam等[19]构建了叶酸-壳聚糖共聚物(FACS)纳米粒,用于阿霉素递送。该体系通过叶酸(Folic acid,FA)受体(Folate receptor,FR)介导的主动靶向作用,特异性识别高表达FR的肿瘤细胞,显著改善了靶向效率。壳聚糖还能作为光氧化响应型壳聚糖纳米载体,利用支化聚乙烯亚胺在光敏剂玫瑰红作用下的氧化降解实现药物光控释放,该策略不仅提高了如紫杉醇的载药效率,还通过胞内活性氧爆发及快速释药,成功规避多重耐药机制,在体外及多重耐药肿瘤模型中均表现出优良疗效[20]。
为了解决BCNU缺乏靶向性、易分解、水溶性差及耐药性等问题,设计了一种兼具低氧响应、低pH响应、AGT抑制活性和FA受体靶向性的多功能纳米载体FCAB用于BCNU的靶向递送,其分子结构如图1所示。在水溶液中,FCAB能够通过自组装行为包裹BCNU形成纳米胶束。该纳米药物能够通过FA介导的主动靶向作用在肿瘤部位聚集。在肿瘤组织特有的低氧和低pH条件下,FCAB中的偶氮键被还原发生断裂而导致纳米壳体碎裂;同时壳聚糖发生质子化而使纳米颗粒发生溶胀,进一步促使壳体的碎裂。载体碎裂释放出具有抗肿瘤活性的BCNU和具有AGT抑制作用的O6-BG衍生物,该设计旨在实现在赋予BCNU靶向性的同时,通过靶向抑制肿瘤组织中的AGT活性而逆转耐药性。
然而,该纳米载体在分子水平上的载药机制,尤其是药物(BCNU)-载体(FCAB)间的相互作用模式、结合位点识别及电子结构演变等关键问题,仍有待系统阐释。本研究通过分子动力学(Molecular dynamics,MD)模拟解析了BCNU@FCAB复合物的动力学行为与包封机制,以期深入揭示FCAB包载BCNU形成纳米胶束的微观过程。
1 计算方法
模拟工作主要采用GROMACS[21]分子动力学软件包完成。FCAB的结构由Charmm-Gui[22]软件绘制,通过Sobtop软件[23]得到BCNU药物和FCAB载体的力场参数及电荷,MD模拟采用GAFF力场[24]。每个模拟系统均置于一个立方体的周期性模拟水盒子当中,并使每个分子与盒子边界的最小距离在所有方向均为1.0 nm,水分子采用简单点电荷(Simple point charge,SPC)模型[25]。先采用最陡下降法和共轭梯度法对体系进行能量最小化直至作用力阈值达到50 kJ/(mol·nm),随后在重原子约束条件下进行100 ps的恒温恒容系综(NVT)平衡模拟,再继续无约束的100 ps等温等压系综(NPT)平衡。采用V-rescale热耦将NVT和NPT系综温度维持在310.15 K,通过 Berendsen压力耦合方法将NPT系综压力控制在0.1 MPa。长程静电相互作用通过粒子网格Ewald法[26]计算,氢原子键长采用LINCS算法[27]约束。所有体系均经过20 ns的平衡模拟,积分步长为2 fs。使用VMD软件包[28]和GROMACS提供的轨迹工具进行可视化。
2 结果与讨论
2.1 FCAB与BCNU作用机制的研究
MD是一种计算方法,用于研究复杂化合物中分子和原子随时间变化的动态行为。通常,计算方法能显著提高药物设计的效率,与分子对接方法不同,MD模拟研究的是靶标的灵活性,结合结合能计算,可以开发出更准确的潜在抑制剂预测。使用了溶剂可及表面积(Solvent-accessible surface area,SASA)、水分子数量、径向分布函数(Radial distribution function,RDF)、分子间氢键数量和聚集数等结构和能量参数,来评估载体-药物复合物的稳定性、动态行为和结合紧密度。通过构建8个FCAB和8个BCNU的体系(8BCNU@8FCAB)进行MD模拟以分析FCAB的聚集行为和BCNU的包封过程。经MD获得的复合物结构如图2a所示,FCAB长链经过MD模拟发生了缠绕与柔性折叠,构建起一个疏松且具有多孔特征的载体网络,BCNU则分布在这些网络之间,从而使得FCAB可以有效包封BCNU分子并形成近似球形的胶束。这种紧密的包裹状态可能源于FCAB与BCNU之间的氢键作用、疏水相互作用以及空间限域效应。
a．结构示意图;b．总能量随时间的变化;c．随时间变化的均方根位移;d．BCNU 5 Å范围内水分子的变化数目
图2 20 ns时8BCNU@8FCAB体系的模拟结果
Fig．2 Simulation result of the 8BCNU@8FCAB system at 20 ns
总能量参数可以作为衡量系统稳定性的指标,能量最小化则能使系统达到尽可能稳定的状态。如图2b所示,MD轨迹表明8BCNU@8FCAB系统的总能量值几乎恒定不变,随着模拟时间未出现明显变化。均方根位移(Root mean square displacement,RMSD)也是衡量系统是否达到平衡的关键指标。如图2c所示,体系的RMSD值在模拟初期迅速上升,随后变化趋于缓慢,最终在 6.4 nm左右波动。RMSD值的平稳波动表明体系在20 ns的模拟时间内已达到稳定状态。
图2d表示了每个FCAB链周边5 Å范围内的水分子数目。结果表明,随着模拟过程的进行,该区域内的水分子数显著减少,并在后期趋于相对稳定。这说明体系在载药和自组装过程中,FCAB周围原有的水分子并不是保持不变的,而是随着BCNU的接近不断被排挤和压缩。
SASA是指溶剂分子能够接触到指定分子的表面积。在药物载体研究中,SASA的变化反映了系统结构的紧凑程度以及药物被包埋的效率。如图3a所示,在聚集过程中,复合物体系的SASA明显降低,最后稳定在104 nm2。这表明纳米粒的结构变得越来越紧密,证明FCAB在水溶液中能够有效聚集。该体系能够自发聚集的原因可能是由于FCAB链中引入了大量的疏水基团(如偶氮苯和O6-BG),促使其在水溶液中发生较强的疏水作用。Ansarinik等[29]提出SASA的降低是形成稳定纳米颗粒的关键步骤,能够确保药物免受溶剂的过早降解。因此,本研究中SASA的降低证明了BCNU能够被FCAB紧密包裹在其形成的疏水内核中。
a．SASA值;b．BCNU与FCAB质心之间的RDF值
图3 8BCNU@8FCAB体系的性能
Fig．3 Performance of the 8BCNU@8FCAB system
RDF可用于描述给定某个粒子周围的其他粒子在空间的分布概率。图3b展示了8BCNU@8FCAB体系RDF峰的位置以及BCNU质心与FCAB质心之间的最近距离。该曲线在r=0.81 nm处出现RDF峰值,之后随着r增大迅速衰减,说明BCNU并不是随机地分布在整个溶液中,而是显著富集在FCAB周围的近邻区域。这一结果表明BCNU在FCAB周围高度浓缩,这有利于 BCNU被封装在FCAB胶束中。
氢键在载药过程中具有重要作用,有助于提高系统的稳定性。如图4a所示,BCNU最多可与水分子形成14个氢键;在模拟过程中,BCNU与水分子之间的氢键数量呈现出一定程度的波动甚至下降趋势。图4b显示了模拟过程中BCNU与FCAB之间的氢键。可以看出,在20 ns的模拟过程中,BCNU与FCAB最多可以形成22个氢键,平均数量为10个。BCNU分子通过其结构中的极性原子与FCAB侧链形成稳定的氢键网络,将其负载在载体上,这是载体负载药物的核心驱动力之一。FCAB与水分子之间的氢键数量如图4c所示。可以看出,FCAB与水分子之间的氢键数量随时间逐渐减少,最终保持稳定在390个左右。这一趋势再次验证了FCAB载体的收缩和脱水过程,随着载体包裹药物并自聚,可供水分子形成氢键的位点减少,意味着载药纳米胶束的形成。
图4 a．8BCNU@8FCAB复合物体系中水分子与BCNU之间的氢键数量;b．BCNU与FCAB之间的键数量;c．FCAB与水分子之间的氢键数量;d．范德华作用能和静电作用能
Fig．4 a．Number of hydrogen bonds between water molecules and BCNU in the 8BCNU@8FCAB complex;b．Number of hydrogen bonds between BCNU and FCAB;c．Number of hydrogen bonds between FCAB and water molecules;d．Van der Waals interaction energy and electrostatic interaction energy
为了识别驱动包载的主要作用力,对载体与药物间的相互作用能进行了分析。如图4d所示,各体系的范德华作用能(vdW)和静电作用能(Electrostatic)均为负值,且其绝对值随模拟时间不断增大,这表明药物与载体之间的吸引力在自组装过程中持续加强。其中,静电作用能远大于范德华作用能,前者约为后者的2～3倍,这表明FCAB和BCNU的极性基团之间形成了强烈的相互作用。这种由强静电作用引导的吸附模式,使得FCAB比普通CS具有更强载药能力,与Wang等[30]在壳聚糖/水杨酸(COS/SA)体系中观察到的以范德华力为主导的情况相反,展现了FCAB在增强极性药物包载方面的优势。
2.2 不同载药量下BCNU@FCAB体系的MD模拟
为了系统评价FCAB的载药性能,构建了4种不同载药量的模拟体系。如表1所示,每个模拟盒子包含8条FCAB链,通过改变BCNU分子的数量(4、8、12和16个),对载药量分别为4.81%、9.18%、13.16%和16.81%的4个体系进行了MD模拟。得到的各体系结构如图5所示,可以观察到,4个体系的FCAB均发生了缠绕与折叠,表现出明显的聚集状态,可以将BCNU负载在载体内部,而随着载药量的增加,特别是16BCNU@8FCAB体系,观察到明显的药物解离现象,部分BCNU因缺乏足够的结合位点而自载体表面脱落并游离至溶剂中。
表1 相同环境温度和压力下具有不同载药量的复合物体系的组成注
Tab．1 Composition of composite systems with different drug loadings under the same ambient temperature and pressure
注:*载药量=MBCNU/(MBCNU+MFCAB),MBCNU为BCNU的质量,MFCAB为载体FCAB的质量。
SystemsNumber of FCAB moleculesNumber of BCNU moleculesDrug loading∗/wt%4BCNU@8FCAB844.818BCNU@8FCAB889.1812BCNU@8FCAB81213.1616BCNU@8FCAB81616.81
图5 MD模拟得到的不同载药量下各复合物体系的分子结构
Fig．5 Molecular structures of various complex systems under different drug loadings obtained through MD simulation
在MD模拟过程中,4个载药体系在模拟的前2 ns内均表现出剧烈的结构变化,RMSD曲线迅速上升,如图6a所示。这表明体系在初始阶段经历了快速的构象调整,药物分子与聚合物链开始相互识别并发生自组装。在2 ns之后,所有曲线均进入了平台期,一直持续到20 ns模拟结束。这说明在当前的力场条件下,FCAB载药体系具有良好的结构稳定性,载体与药物形成的复合物在动态环境下能够保持稳固的结合,没有发生大规模的解离。平衡后的RMSD值大致分布在 6.4～7.1 nm之间。比较不同载药量的复合物体系可以看出,4BCNU@8FCAB和16BCNU@8FCAB体系对应的RMSD值略高,而中等载药量的8BCNU@8FCAB和12BCNU@8FCAB体系的RMSD略低,这表明在9.18%和13.16%的载药量下,载体与药物能形成较稳定的自组装形态;反之,过高或过低的载药量均不利于复合物体系的稳定。
a．随时间变化的均方根偏差;b．BCNU的均方位移;c．FCAB的溶剂可及表面积;d．FCAB周围BCNU的径向分布函数
图6 不同载药量下各复合物体系的模拟结果
Fig．6 Simulation results of various complex systems with different drug loadings
均方位移(Mean square displacement,MSD)体现了药物分子的迁移速率,能够反映药物扩散受限的程度及在载体内部的运动状态。如图6b所示,12BCNU@8FCAB体系表现出最强的扩散能力,其MSD值在20 ns时接近27 Å2,这意味着在此载药量下,纳米颗粒具有更加高效的扩散迁移能力。16BCNU@8FCAB体系虽然载药量更高,但其扩散能力反而低于12BCNU@8FCAB体系,这说明当载药量达到一定阈值时,体系内部的堆积变得紧密,这可能导致产生空间位阻效应,从而限制了分子的自由扩散。8BCNU@8FCAB体系药物扩散最慢,说明该比例下药物分子被牢牢锁定在FCAB载体中,从而有利于长效缓释。
由图6c可以看出,所有体系的SASA从初始的约190～200 nm2迅速下降。在10 ns左右基本达到动态平衡,最终稳定在100～120 nm2,这表明FCAB载体在水溶液中具有理想的自组装能力,能够迅速通过疏水作用将药物分子包裹在其内部核心。16BCNU@8FCAB体系的SASA值最高,约为115 nm2这是因为更多的药物分子增加了聚集体的总体积。而4BCNU@8FCAB体系的SASA值最低,约为100 nm2,这说明低载药量下,复合物体系会聚集形成更小、更紧凑的纳米颗粒。
如图6d所示,4个体系的峰值均出现在RDF为0.7～0.8 nm附近,这说明无论载药量如何变化,FCAB与BCNU之间的基本作用距离是恒定的。4BCNU@8FCAB体系的RDF峰值最高,这表明在该载药量下,药物分子被紧密地局限在载体的特定空间内。随着载药量增加,峰值逐渐降低且峰宽略有增加。这说明随着载药量的增高,药物分子在载体内部的分布变得更加分散,从点状富集转变为区域分布。
2.3 FCAB在不同聚合度下BCNU@FCAB体系的MD模拟
研究了FCAB聚合度对复合物体系载药和释药能力的影响。按照如表2所示构建了4种复合物体系,这4种体系的载药量均为9.18%,FCnAB分子中壳聚糖的聚合度(即n值)分别设定为8、12、16和20。MD模拟得到各体系的结构如图7所示。可以看出,经过MD模拟后,原本分散分布在水盒子中的FCAB与BCNU逐渐聚集,均形成了稳定的复合物结构。然而,不同聚合度的FCAB体系表现出明显的差异:8BCNU@8FC8AB和8BCNU@4FC20AB体系中,FCAB对BCNU的包裹更加紧密,而其他2个体系包裹地较为松散;除8BCNU@8FC8AB体系外,其他3个体系中均有小部分BCNU分子发生了解离。
表2 不同聚合度FCAB与BCNU形成复合物体系的组成注
Tab．2 Composition of the complex system formed by FCAB with varying degrees of polymerization and BCNU
注:*n代表FCAB中壳聚糖的聚合度。
SystemsNumber of FCnAB molecules∗Number of BCNU moleculesPolymerization degree of FCnAB8BCNU@8FC8AB8888BCNU@6FC12AB68128BCNU@5FC16AB58168BCNU@4FC20AB4820
图7 MD模拟得到的不同FCAB聚合度下复合物体系的分子结构
Fig．7 Molecular structures of the complex system obtained through MD simulation at different polymerization degrees of FCAB
从图8a可以看出,所有体系均在2 ns后基本进入相对稳定阶段。其中,8BCNU@8FC8AB体系达到稳定时的RMSD值最低(约为6.6 nm),8BCNU@4FC20AB体系达到稳定时的RMSD值最高(约为11.5 nm),这表明FCAB聚合度为8时负载BCNU会更加稳定。
a．随时间变化的均方根位移;b．BCNU的均方位移;c．FCAB的溶剂可及表面积;d．FCAB周围BCNU的径向分布函数
图8 不同FCAB聚合度下各复合物体系的模拟结果
Fig．8 Simulation results of various complex systems with different degrees of polymerization of FCAB
由图8b可以观察到,4条曲线呈现出不同的斜率。8BCNU@5FC16AB体系表现出了极高的MSD值,20 ns时超过300 Å2,远高于其他体系。这表明FCAB在聚合度为16时,BCNU有较大的活动自由度。8BCNU@8FC8AB体系的MSD曲线几乎水平,说明在该体系中,BCNU被牢牢锁定在FCAB中,不容易发生扩散,从而有利于长效缓释。
图8c为各体系SASA值的变化曲线,4条曲线均呈现初期快速下降、后期趋于平稳的特征。其中,8BCNU@4FC20AB的SASA值下降最为剧烈,最终稳定在约65～70 nm2之间,表明长链FCAB形成的纳米颗粒最为致密。8BCNU@6FC12AB体系的SASA值保持在较高水平,约为125 nm2,这意味着该体系的结构较为松散,导致暴露面积较大。
图8d反映了BCNU在不同聚合度FCAB载体中的分布概率密度。结果表明,所有体系的峰值均出现在0.5～1.0 nm之间,8BCNU@4FC20AB体系的RDF峰值最高(为73),这说明长链载体更有利于药物分子在载体表面的局部聚集;与之相对的是8BCNU@8FC8AB体系的峰值最低,表明BCNU在较短链系统中的分布更加分散。
本工作主要通过MD模拟探究FCAB载体对BCNU的封装机制与结构稳定性,属于理论计算研究范畴。文中提及的FCAB载体的低氧/pH响应性、FA受体靶向性及AGT抑制介导的耐药逆转功能,是基于其分子结构设计的理论预期,尚未通过细胞或动物实验验证。后续工作将开展体外和体内实验,以全面评估FCAB@BCNU纳米药物的实际生物学功能。
3 结论
本研究通过MD模拟,系统地探究了多功能修饰壳聚糖载体FCAB对BCNU的封装机制、自组装行为及其结构稳定性。结果表明,FCAB在水溶液中能通过自组装过程将BCNU紧密包裹在其内部核心,形成稳定的纳米胶束。系统的总能量和RMSD曲线表明该载药体系具有良好的动力学稳定性;BCNU与FCAB之间形成了稳定的氢键网络,从而实现了有效载药;FCAB与BCNU间的相互作用主要依赖于静电作用。对具有不同载药量的复合物体系的MD模拟表明,FCAB对BCNU的包载行为具有明显的剂量相关性。在9.18%～13.16%的载药量范围内,体系表现出较佳的结构稳定性;中等载药量(9.18%)下药物扩散速率最慢,有利于实现长效缓释。此外,FCAB链的长度是影响BCNU负载行为的重要结构参数。当FCAB聚合度为20时,复合物体系的SASA最低且RDF峰值最高,表明长链更有利于形成紧凑的疏水内核并实现药物的局部高度富集。
综上所述,FCAB作为一种兼具靶向性和多重响应机制的纳米载体,能够通过强烈的静电及氢键作用高效封装BCNU。本研究从分子水平揭示了其微观作用机制,为开发新型抗肿瘤药物递送系统提供了重要的理论依据。
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