液相色谱-串联质谱法同时检测血液中25种有机磷农药

在农业及其他生产活动中,农药被普遍采用。根据其分子结构的差异,这些农药通常被区分为4大类,分别是有机氯、有机磷、氨基甲酸酯与拟除虫菊酯[1,2]。其中,有机磷类农药(OPs)因杀虫谱广、作用迅速等优点,成为全球使用量最大、品种最多的农药类别之一。由于有机磷农药的利用率较低,其大部分成分无法降解,而是长期存留于环境,并在生物体中持续蓄积,最终使其成为危及生态平衡与人类健康的无声威胁[3]。OPs的毒理机制主要表现为乙酰胆碱酯酶被其抑制,使乙酰胆碱无法正常分解,在体内不断蓄积。这种蓄积使得胆碱能神经受到持续性冲动,机体先呈兴奋状态,后转入衰竭,并出现烟碱样、毒蕈碱样以及中枢神经系统受累的一系列体征。危重病例可进一步出现中间综合征,最终因呼吸肌功能丧失而死亡[4,5]。

OPs种类繁多,市场监管不严,误服引起的急性中毒事件时有发生。同时,因其毒性强、易获取,也常成为自杀或投毒杀人的工具。在中毒患者的救治和死亡原因判定中,生物检材中农药的定性、定量检测具有不可替代的价值。血液作为体内毒物转运的核心介质,其农药浓度可直接反映中毒剂量和吸收程度,为临床实施血液灌流、特效解毒剂治疗等提供关键依据。在临床及法医毒理学领域,常需对血液、尿液、胃内容物和内脏器官等生物检材开展毒物筛查与定量检测,以此查明发病或死亡原因[3,6,7]。因此,建立准确、灵敏、高通量的血液中多农药同时检测方法,对保障公共健康和司法公正具有重要意义。

在已报道的文献中,农药检测方法主要有气相色谱法(GC)[8,9]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[10-17]、液相色谱法(LC)[18]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[19-21]等。GC和GC-MS对挥发性、热稳定性好的农药分析具有优势。但对于多数OPs(如乐果、氧乐果、乙酰甲胺磷等)而言,其极性较强、热稳定性较差,直接进行GC和GC-MS分析往往需要复杂的衍生化前处理,不仅耗时费力,还可能引入误差。LC虽可避免衍生化,但常规紫外或荧光检测器在复杂生物基质中的选择性和灵敏度有限,难以满足痕量分析需求。LC-MS/MS技术集液相色谱优异的分离效能与串联质谱出色的选择性和灵敏度于一体,对极性较强、热稳定性差且蒸气压较低的化合物具有显著的分析优势[22-24]。该技术样品前处理简便,无需衍生化,且多反应监测(MRM)模式可有效降低基质干扰,已在生物样品中毒物筛查与确证中得到广泛应用。本研究选取敌敌畏、敌百虫等25种常见OPs,结合LC-MS/MS技术进行分析研究,通过优化前处理条件和仪器条件,建立了同时测定血液中25种OPs的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

LCMS-8060NX型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(配备Shim-pack GIST C18-AQ色谱柱(1.9 μm,2.1 mm×100 mm),日本Shimadzu公司);TGL18M型台式高速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司);SI-0236 VORTEX-GENIE2型涡旋振荡器(美国Scientific Industries公司);Milli-Q Reference型超纯水发生器(美国Millipore公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵(色谱纯,上海麦克林生化科技股份有限公司);敌敌畏、敌百虫等25种OPs标准物质溶液(纯度≥99.5%,上海安谱实验科技股份有限公司),具体信息见表1。

1.2 标准溶液的制备

分别移取质量浓度为100.0 μg/mL的OPs单一标准物质溶液于1 mL容量瓶中,以甲醇为溶剂,制备1 μg/mL的混合标准物质工作溶液,密封,-20 ℃保存,有效期1个月。实验前用甲醇稀释,配制成系列浓度的混合标准溶液。4 ℃保存,有效期7 d。

1.3 前处理方法

血液移取前,应充分混匀。精密移取0.5 mL血液于15 mL塑料离心管中,加入2.5 mL V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合液,涡旋振荡5 min后以8000 r/min离心10 min,取上清液经0.22 μm尼龙微孔滤膜过滤,待测。

1.4 仪器条件

液相色谱条件:流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液,进样量为 3 μL,柱温为40 ℃。梯度洗脱程序见表2。

质谱条件:采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+),多反应监测(MRM)模式检测。雾化气、干燥气和加热气流量分别为3、10、10 L/min;脱溶剂管温度、接口温度、加热块温度分别为150、350、400 ℃,接口电压1 kV。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

采用质量浓度100 ng/mL的25种OPs的混合标准液,在质荷比(m/z)为100～400的范围内进行一级全扫描。结果表明,25种OPs都可产生响应较好的[M+H]+峰。分别以得到的[M+H]+进行二级扫描分析,通过优化碰撞能量等参数,选择丰度高、稳定性好的2个子离子作为定性、定量特征离子,质谱参数见表1。

2.2 色谱条件优化

比较了0.1%甲酸水溶液、纯水、5 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇、乙腈和V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1溶液作为流动相对25种OPs色谱分离的效果。结果表明,在0.1%甲酸水溶液作为水相、甲醇作为有机相时,25种OPs的响应最好。这是因为甲酸和质子化溶剂甲醇能够有助于目标物形成[M+H]+峰,从而增强目标物的响应。在此基础上,考察以0.1%甲酸甲醇溶液为有机相时的检测分析结果。与不加甲酸时相比,25种OPs的响应强度没有明显增加,但甲基毒死蜱、特丁硫磷、毒死蜱、乙硫磷、丙溴磷等5种目标物的响应更稳定。因此从灵敏度和稳定性考虑,最终确定0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸甲醇溶液为流动相。25种OPs的总离子流色谱图见图1。

2.3 进样量选择

进样量过少会使低含量的组分色谱响应较低,影响方法的灵敏度;进样量过多时,易使样品中出峰较早的物质发生溶剂效应,或使样品过载超过线性范围,影响方法的准确度。实验以质量浓度100 ng/L甲胺磷和乙酰甲胺磷标准溶液为例,考察了1、2、3、4 μL不同进样量对样品响应的影响。图2结果表明,随着进样量的增加,各物质的峰面积响应也呈比例增大。然而,当进样量为4 μL时,甲胺磷和乙酰甲胺磷的色谱峰因溶剂效应产生峰分裂和峰展宽,且通过调整流动相比例也无法消除溶剂效应的影响。因此,综合考虑进样量对100 ng/L标准溶液的影响,选择进样量为3 μL。

2.4 前处理条件优化

考察了甲醇、乙腈、V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液等不同提取溶剂对血液中25种OPs的提取效果。结果表明,采用V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液作为提取溶剂时,血液中25种OPs响应均为最强,各物质峰面积见图3。在此基础上,实验选择血液与V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液体积比分别为1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9,考察了提取溶剂使用量对25种目标物提取效果。结果显示,当两者体积比为1∶1时,提取液呈红色浑浊状态,表明此用量的提取溶剂沉淀蛋白能力不足;在体积比为1∶3时,除甲基毒死蜱的提取回收率高达147.67%外,其余24种目标物的提取回收率处于84.67%～129.81%之间;当体积比由1∶5到1∶9时,25种OPs的回收率无明显差异,处于80.0%～130.0%之间。考虑到过多的提取溶剂不仅会造成试剂浪费,而且会降低各目标物的浓度,选择血液与V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液体积比为1∶5。

2.5 方法学评价

制作健康志愿者的血液作为空白样本,取100 ng/mL的25种OPs混合溶液加入空白样本,使用本方法进行专属性考察。在空白血液样本中,未发现25种OPs的色谱峰;在添加样本中,25种OPs的峰形良好,敌敌畏、敌百虫、乙拌磷砜、乐果、甲基毒死蜱、甲胺磷、乙酰甲胺磷、乙拌磷、甲拌磷、特丁硫磷、氧乐果、辛硫磷、久效磷、毒死蜱、硫线磷、乙硫磷、氯唑磷、甲基异柳磷、伏杀硫磷、丙溴磷、哒嗪硫磷、甲基立枯磷、治螟磷、三唑磷、杀扑磷的保留时间分别为5.72、3.50、6.72、3.68、6.03、1.73、1.93、8.94、8.85、9.50、2.05、8.90、2.66、9.98、8.90、9.80、8.04、8.48、8.82、9.33、7.97、8.99、8.52、8.12、7.29 min,表明空白血液对25种OPs的检测没有干扰,方法具有较好的专属性。

由于血液成分复杂,因此实验采用校准曲线斜率法,以基质标曲和溶剂标曲的斜率的比值计算ME值,评价本实验的基质效应。由表3可知,乙拌磷砜的基质效应为141.47%,表现为基质增强效应;甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷和乙拌磷等4种目标物的基质效应处于22.47%～79.24%之间,均表现为基质抑制效应;其余20种物质的基质效应在80.70%～119.67%之间,可认为没有明显的基质抑制或者基质增强作用。综合考虑各物质的基质效应,选择基质加标法开展定量实验。

2.5.3 线性范围和检出限

按照1.3步骤制作不含目标物的空白血液提取液,加入一定体积的25种OPs混合标准溶液,配制成系列质量浓度的基质加标溶液。以信噪比(S/N)为3对应的浓度确定25种OPs的检出限(LOD),以信噪比(S/N)为10对应的浓度确定25种OPs的定量限(LOQ)。由表3可知,血液中25种OPs在10～250 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数均不小于0.992,LOD为0.02～2.53 ng/mL,LOQ为0.05～8.33 ng/mL,表明该方法具有较高的灵敏度。

2.5.4 回收率和精密度

向不含目标物的空白血液中添加一定体积的25种OPs的混合标准溶液,制作成浓度分别为20、100、200 ng/mL的加标样品,测定并计算回收率。每个浓度平行测定6次,计算各目标物相对标准偏差(RSD)。表4结果显示,血液中25种OPs的回收率为67.57%～129.35%,RSD为0.37%～12.85%,表明方法准确、可靠,能满足血液中25种OPs的分析要求。

2.6 方法应用

2026年5月,办案民警依法提取了一起意外死亡事件死者的血液样本,并送至本单位进行毒物检验。依据本文所建立的分析方法,对送检的心血样品进行了系统检测。结果显示,在死者血液中检出敌敌畏成分,其含量为152.68 ng/mL。实验结果表明该方法可用于血液中OPs检测,能有效应用于OPs中毒案件的法医学鉴定。

3 结论

本文采用V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液为提取溶剂,建立了LC-MS/MS同时测定血液中25种OPs的方法。实验结果表明,该方法的检出限、定量限、线性方程、回收率及精密度等技术指标都能满足实际测试需求。该检测方法具备操作简便、分析迅速、灵敏度高、稳定性佳等优势,单针进样可同时对血液中25种OPs进行定性定量分析。应用该方法对实际血液样品进行检测,具有较高的实用性,对于实际执法具有重要意义。

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