液相色谱-串联质谱法测定胶粘剂中常见环境激素

双酚A、烷基酚(AP)和烷基酚聚氧乙烯醚(APnEO)具有较强的生态毒理效应以及生物累积性,通过食物链在动物和人体内积聚,影响哺乳类动物的生殖能力,甚至引发癌症,被称为“环境激素”[1-5]。欧盟早在2003年就通过了第2003/53/EC号指令,限制了壬基酚和壬基酚聚氧乙烯醚的使用。我国对此类环境激素的使用和残留也作了相关规定,如规定洗涤剂中不得添加烷基酚[6];双酚A不得在婴幼儿专用食品接触材料中检出,在其他食品接触用材料中迁移量不能超过0.05 mg/kg[7]。

双酚A、烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的分析方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)及液相色谱-质谱法(LC-MS)等[8-17],主要涉及水、土壤、水产品、纺织品、化妆品等各类样品,而对于食品包装材料的报道较少[18-20]。GC-MS法一般只能测定AP及短链APnEO(n=1～2),而对于高聚合度的烷基酚聚氧乙烯醚需要衍生化后才能用GC-MS测定;HPLC方法的灵敏度较低、定性能力较差,且易出现假阳性结果;LC-MS法则同时兼具定性、定量准确的优点,可同时测定AP和APnEO。因此,本研究旨在建立一种采用液相色谱-串联质谱技术同时测定食品用胶粘剂中双酚A、烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的检测方法,并组织多家实验室开展共同实验,对方法的重复性和再现性进行评价,以期为食品包装材料的质量安全管控提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

ACQUITY-Class型超高效液相色谱仪、Xevo TQS型四极杆串联质谱仪(美国Waters公司);ME54E型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);8800型超声波发生器(使用功率不低于350 W,美国Branson公司);5810-R型高速离心机(美国Eppendorf公司)。

甲醇(色谱纯,韩国德山公司);双酚A(CAS:80-05-7,纯度99.7%)、对叔辛基酚(OP,CAS:140-66-9,纯度99.9%)、4-壬基酚(NP,CAS号:25154-52-3,纯度99.8%)、辛基酚聚氧乙烯醚(CAS:9002-93-1,纯度99.1%)、壬基酚聚氧乙烯醚(CAS:9016-45-9,纯度99.8%)(上海安谱实验科技股份有限公司);超纯水(自制)。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 一级标准储备溶液

分别准确称取0.01 g(精确至0.1 mg)的双酚A、辛基酚、壬基酚、辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚,用甲醇溶解,转移至100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度并摇匀,配制成浓度为0.1 mg/mL的一级标准储备溶液。在0～4 ℃条件下密封避光贮存,有效期3个月。

1.2.2 二级标准储备溶液

准确移取1000 μL一级标准储备溶液于 10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成浓度为10.0 μg/mL的二级标准储备溶液。在0～4 ℃条件下密封避光贮存,有效期3个月。

1.2.3 系列标准工作溶液

根据样品实际含量配制合适浓度的系列标准工作溶液,分别准确移取0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、2.5 mL的二级标准储备溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,配得浓度分别为20、50、100、200、400、500 ng/mL的系列标准工作溶液,现配现用。

1.3 样品提取

称取0.3 g(精确至0.1 mg)胶粘剂于50 mL具塞三角瓶中,用5 mL水分散后再加入20 mL甲醇,超声萃取30 min,移取1.5 mL萃取液于2 mL离心管中高速离心10 min(转速为10000 r/min),然后将上清液用0.22 μm有机相滤膜过滤,滤液稀释2倍后进LC-MS/MS检测。每个样品重复测定两次,每批样品做一组空白。若待测试样溶液的浓度超出标准工作曲线浓度范围,则对试样稀释倍数适当调整后重新测定。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱:XDB-C18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm),柱温:40 ℃;进样量:10 μL。流动相为甲醇(A)和水(B),流速:300 μL/min;梯度洗脱程序为0～1.0 min,A相由40%增加至95%,B相由60%降低至5%;1.0～9.0 min,保持A相95%,B相5%;9.0～9.1 min,A相由95%降低至40%,B相由5%提升至60%;9.1～15.0 min,保持A相40%,B相60%。

扫描方式:双酚A、辛基酚和壬基酚采用负离子扫描;辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚采用正离子扫描;离子源为电喷雾电离源(ESI);监测方式为多反应监测(MRM);雾化气压力为0.414 MPa;气帘气压力为0.124 MPa;辅助加热气压力为0.414 MPa;离子源温度为500 ℃;碰撞气压力为0.069 MPa;电喷雾电压、化合物的定量离子对、定性离子对、去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

烷基酚及双酚A分子结构中含有酚羟基,与ESI+电离方式相比,在ESI-电离方式下母离子响应更高。以[M-H]-为母离子,在ESI-模式下进行子离子扫描,扫描质量范围(m/z)为50～250,选择稳定性好以及响应值高的2个碎片离子分别作为定量和定性离子。在多反应监测(MRM)负离子模式下优化BPA、OP和NP的质谱参数,详见表1。辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚均含有醚氧基团,在正离子模式下形成的[M+NH4]+响应最高。相邻聚合度的OPnEO和NPnEO间隔1个乙氧基,相对分子质量相差44。OPnEO分子离子主要分布为m/z=(224+44n)(n=2～16),NPnEO分子离子主要分布为m/z=(238+44n)(n=2～16)。在多反应监测(MRM)正离子模式下优化OPnEO和NPnEO的质谱参数,详见表1。

2.2 提取溶剂的选择

根据双酚A、烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的理化性质以及文献报道[21,22],考察了采用甲醇、乙腈以及不同V(甲醇)∶V(水)(包括75∶25和50∶50)时样品萃取的结果。

实验结果表明采用乙腈为萃取溶剂时,样品溶液有絮状沉淀产生,振荡后不能溶解,离心后不能分层,且无法用滤膜过滤干净,因此未选择乙腈作为提取溶剂。

采用空白加标的方法制备各目标物含量为10 mg/kg的水基胶阳性样品。称取0.3 g阳性样品,加入5 mL水分散后分别加入20 mL的甲醇以及V(甲醇)∶V(水)(包括75∶25和50∶50)进行萃取,离心后取上层清液过滤后进行分析,结果见表2。从表2可以看出,采用甲醇作为提取溶液的效果要优于不同V(甲醇)∶V(水)混合溶液,这可能因为水基胶为水溶性/水分散型高分子聚合物(丙烯酸乳液、聚氨酯乳液等),高分子链依靠氢键、疏水作用交联形成致密凝胶网络:1)加入少量纯水可预分散样品,水分子与聚合物亲水基团结合,使胶黏剂网状结构适度溶胀、链间隙扩大,使原本包裹在聚合物内部的目标污染物暴露,便于后续提取;2)预分散后加入纯甲醇,一方面打断聚合物与目标物之间的氢键、范德华力吸附;另一方面甲醇可置换高分子内部结合水,进一步撑开高分子网络,同时依靠对酚类、酚醚的高溶解能力,将目标物从基质中剥离并溶解至有机相;3)若使用甲醇-水混合液替代纯甲醇萃取,混合溶剂中过量水会维持聚合物高度水化交联状态,高分子链不易被甲醇置换、松弛,同时混合溶剂溶解能力不足,无法高效溶出疏水烷基酚类物质,提取效率显著下降,因此最终萃取溶液选用甲醇。

2.3 标准储备溶液稳定性考察

为考察待测化合物一级标准储备溶液和二级标准储备溶液的稳定性,将其放置在4 ℃环境中,在0、7、14、30、60、90 d,分别以待测化合物的一级标准储备溶液和二级标准储备溶液为母液,配制50、500 ng/mL的待测溶液。每次测试均以有效期内的固体标准品制备新的标准工作溶液对待测溶液进行测定,测定结果见表3。依据GB/T 15000.3《标准样品工作导则第3部分:标准样品定值和均匀性与稳定性评估》[23]中有关稳定性研究的方法对标准溶液稳定性进行评估。若|b1|<t0.95,4×S(b1),说明样品的浓度随时间变化无明显差异,样品具有较好的稳定性。从表3可以看出,90 d内一级标准储备溶液和二级标准储备溶液的稳定性良好。双酚A、烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚在甲醇溶剂中性质相对稳定,但因甲醇沸点较低,容易挥发,因此,储存条件确定为:在0～4 ℃下避光密闭保存,有效期3个月。

2.4 提取溶液稳定性考察

为考察待测化合物在提取液中的稳定性,以水基胶的空白加标样品为例,将提取液在室温(20 ℃)放置0、1、2、6、12、24 h后进样。不同时间进样后的测定结果见表4。从表4可以看出,24 h内样品提取液中5种化合物的稳定性良好。

2.5 方法学评价

在HPLC-MS/MS分析过程中,共洗脱物会影响分析物的离子化,这种现象称为基质效应。基质效应分为基质抑制和基质增强,基质抑制使分析物的质谱响应降低,而基质增强则使分析物的质谱响应增加。本文以空白实际样品为研究对象,采用空白基质匹配标准工作曲线法考察了不同稀释倍数下各化合物的基质效应(ME),基质效应按公式(1)计算。

式中,S样品为空白样品提取液配制的标准工作曲线斜率;S甲醇为纯甲醇配制的标准工作曲线斜率。

如表5所示,随着稀释倍数增加,所有分析物的基质效应在逐渐降低,稀释2倍时烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的基质效应降至±10%以内,此时基质效应对烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚定量的影响可以忽略。由于稀释倍数的增加会减低方法的灵敏度,因此本文将样品稀释2倍后进样分析。

2.5.2 方法的线性范围、检出限、定量限

对标准工作溶液进行LC-MS/MS分析,以目标物的色谱峰面积为纵坐标(Y),目标物浓度为横坐标(X),进行线性回归分析,得到各目标物的标准工作曲线和线性回归方程。以3倍信噪比确定检出限(LOD),以10倍信噪比确定定量限(LOQ)。所得方法的线性范围、相关系数、检出限和定量限的结果如表6所示。实际样品加标色谱图、空白样品色谱图见图1、图2,由图可知,在目标物保留时间窗口内无干扰峰出现,说明方法的特异性良好。

2.5.3 方法的准确度和精密度

选取空白胶粘剂进行回收率实验,分别在低、中、高3个含量水平下进行样品加标回收率试验,每天进行5次重复性实验,连续处理3 d,结果见表7。可以看出,各目标物的加标回收率在88.4%～102.0%之间,日内相对标准偏差 <6.0%,日间相对标准偏差<8.0%,均满足定量分析要求。

2.5.4 方法的重复性限和再现性限

为验证本方法的稳定性,并对方法的重复性和再现性进行评价,组织了6家实验室进行共同实验。共同实验选取2个样品进行比对,测定结果如表8所示。依据GB/T 6379.2—2004《测量方法与结果的准确度(正确度和精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性和再现性的基本方法》[24]对各实验室数据进行分析,经格拉布斯(Grubbs)检验(置信概率95%)后,获得2个样品各实验室间总平均值(m)下该方法的重复性标准差(Sr)和再现性标准差(SR),并按照公式(2)和(3)计算95%置信概率水平下的重复性限(r)和再现性限(R),并按照公式(4)和公式(5)计算相对重复性标准差(RSDr)和相对再现性标准差(RSDR),结果如表8所示。

由表8可知,目标物的r和R分别在0.15～1.68和0.30～1.78之间;RSDr和RSDR分别在2.09%～8.96%和4.00%～8.29%之间。说明本方法具有良好的重复性和再现性。

2.6 实际样品测定

采用所建立的方法测定了20个实际样品。20个试样中有1个样品检出壬基酚,含量为8.80 mg/kg;另有1个样品检出辛基酚聚氧乙烯醚,含量为318.52 mg/kg;有2个样品检出壬基酚聚氧乙烯醚,含量分别为56.60、342.26 mg/kg;所有样品均未检出双酚A和辛基酚。烷基酚聚氧乙烯醚及其降解产物壬基酚、辛基酚均为内分泌干扰物,可干扰人体激素平衡,高残留样品具备更高长期累积暴露风险。该类水基胶常应用于食品包装、纸质食品容器等食品接触场景,胶内酚醚与烷基酚残留物存在向食品迁移的潜在风险。油脂、酸性、高温食品介质会通过相似相溶、氢键解离作用溶出胶层中游离污染物,实现膳食途径暴露;基体数百mg/kg级高残留会显著增大迁移超标的概率。尽管基体总残留无法完全等同于实际迁移量,但基体总残留检测可作为产品风险前置筛查指标,具备重要警示意义。

3 结论

本文建立了胶粘剂中双酚A、辛基酚、壬基酚、辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的液相色谱串联质谱检测方法。该方法具有良好的重复性和再现性,与液相色谱方法相比,具有高准确度、高通量等优势,适用于食品包装用胶粘剂中双酚A、烷基酚和烷基酚聚氧乙烯醚的快速、准确检测。未来实际检测中,可结合高分辨质谱的精准筛查能力,首先确定目标成分,再采用LC-MS/MS方法进行准确定量,从而实现目标成分的精准覆盖和定量。

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