外泌体即时检测技术在肿瘤液体活检中的研究进展

世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的GLOBOCAN 2022数据显示,2022年全球癌症新发病例约1997.6万例,癌症相关死亡约970万例。全球癌症负担持续加重,已成为威胁公共卫生及社会经济发展的重大疾病[1]。临床实践表明,早期发现、早期诊断以及全病程动态监测是提高患者五年生存率、实现临床治愈的关键环节[2]。然而,传统肿瘤筛查手段(如影像学检查、组织穿刺活检)普遍存在检出滞后、侵入性强、难以实现高频动态监测等固有局限,严重制约了肿瘤的早期防控与精准管理[3,4]。

近年来,即时检测(Point-of-care testing,POCT)技术凭借其快速响应、便携操作及成本低廉的优势,为诊断窗口前移和肿瘤社区化筛查提供了新途径[5]。特别是基于肿瘤外泌体的POCT平台,通过将样本富集、信号转导与快速检测模块有机结合,能够在复杂生物样本中实现微量肿瘤标志物的高效捕获与精准定量,已成为分析化学、化学生物学及临床检验医学等领域的前沿热点[6]。本文系统综述了肿瘤外泌体POCT技术的最新研究进展,重点剖析其关键技术瓶颈与临床转化策略,以期为肿瘤早期诊断提供新的技术参考[7,8]。

1 外泌体POCT的分析挑战

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由细胞释放的膜性囊泡总称,主要包括外泌体、微囊泡及凋亡小体等不同亚型。其中,外泌体(Exosomes)通常指由内体-多囊泡体途径形成并经细胞膜融合释放的纳米级小细胞外囊泡,粒径一般为30～150 nm[9,10]。需要指出的是,当前部分外泌体POCT研究在文献表述中常将“Exosomes”“Small extracellular vesicles(sEVs)”与“EVs”交叉使用。为保持概念严谨性,本文以肿瘤来源外泌体为主要讨论对象;当所引文献的研究对象表述为EVs或sEVs时,本文保留其原始术语,并在具体语境中说明其与外泌体的关系。作为细胞间通讯的重要媒介,外泌体广泛分布于血液、尿液、唾液等多种体液[11],其内容物涵盖核酸(mRNA、miRNA、ncRNA及DNA片段)、脂质、糖类及特异性膜蛋白(如4次跨膜蛋白超家族成员、热休克蛋白、整合素等),能够真实反映母细胞的生理病理状态。在肿瘤微环境中,外泌体通过介导肿瘤细胞转移、侵袭及耐药性形成等过程发挥关键调控作用[12]。值得关注的是,肿瘤源性外泌体具有显著的时空异质性——不同组织来源、不同疾病进展阶段的外泌体在分子组成上差异显著。这一特性既赋予其作为肿瘤特异性标志物的独特优势,也对检测技术的灵敏度与特异性提出了严苛要求[13,14]。

目前,外泌体标志物的临床POCT转化面临双重瓶颈:一方面,肿瘤外泌体在复杂生物基质中丰度低,需从背景蛋白及细胞碎片中选择性富集,且信号易被脂蛋白等干扰物掩蔽[15];另一方面,以超速离心和免疫印迹(WB)为代表的传统“金标准”方法流程冗长、设备依赖性强,难以满足床旁快速检测的需求[15-17]。因此,POCT平台须在微量样本(μL级)、复杂基质(高背景干扰)及非标准环境(温度波动、操作变异)三重约束下,实现高灵敏度、高特异性的稳健检测[18,19]。这要求检测系统必须完成从“粗放分离”向“集成化精准传感”的跨越,即同步实现外泌体的高效富集、特异性识别与信号放大——这是当前外泌体POCT领域的核心难题[20,21]。

如表1所示,传统实验室检测与POCT策略在技术范式上存在本质差异:前者追求分离纯化后的精准定量,后者强调复杂基质中的原位快速检测[22,23]。这种范式转换不仅是技术路线的调整,更提出了从“理想条件”向“真实场景”跨越的核心挑战——即如何在保留高灵敏度的同时,实现复杂生物基质中微量外泌体的高灵敏度及高特异性识别与稳健定量[24]。下文将系统阐述当前肿瘤外泌体POCT的关键传感技术与集成策略。

2 外泌体POCT的核心化学传感技术

从系统构成上看,外泌体POCT平台通常包括样本预处理、外泌体富集、特异性识别、信号转导和结果读取等多个模块。本节所讨论的“核心化学传感技术”并非将光学传感、电化学传感、微流控芯片和纸基器件置于完全相同的概念层级,而是从“信号转导机制”和“平台集成载体”两个维度进行归纳。其中,光学传感与电化学传感主要承担信号转导功能,重点解决外泌体识别事件如何转化为可检测信号以及如何实现信号放大的问题;微流控芯片和纸基分析器件则主要作为传感体系的集成化载体,用于完成微量样本操控、外泌体富集、反应时序控制和便携化读出。二者在实际POCT平台中并非相互独立,而是存在明显交叉:光学或电化学传感常被集成于微流控芯片或纸基器件中,从而实现从样本预处理到信号读取的一体化检测。

此外,肿瘤来源外泌体具有显著异质性,其粒径、膜蛋白组成及内含核酸均可能与正常细胞来源外泌体存在重叠,单一标志物检测容易受到非肿瘤来源外泌体干扰,从而增加假阳性风险。因此,近年来外泌体POCT平台逐渐由单靶标检测转向多靶点联合识别和逻辑门传感。常见策略包括:以CD9、CD63、CD81等4次跨膜蛋白作为外泌体身份确认标志物,同时联合EpCAM、HER2、EGFR、PD-L1等肿瘤相关标志物进行来源判别;或通过“AND”逻辑门设计,要求外泌体通用标志物与肿瘤特异性标志物同时存在时才触发显著信号输出。此外,微流控多通道结构、纸基空间编码阵列及多模态信号读出还可实现膜蛋白与miRNA、circRNA等核酸标志物的正交验证,从而提高肿瘤源性外泌体识别的特异性和临床判别能力。

2.1 基于光学传感的外泌体POCT

光学生物传感器通过将特异性生物识别事件转化为可定量的光学信号,实现对化学及生物信息的高灵敏分析。凭借出色的灵敏度、成像可视化能力以及良好的生物相容性,该技术已成为外泌体POCT中应用最为广泛的传感模式[25]。其核心机制在于:经化学功能化修饰的光学探针与外泌体表面标志物发生特异性识别与结合,进而触发比色、光谱位移或荧光强度等光学信号的变化,最终实现外泌体的定性判别与定量分析[26]。目前,基于比色分析和荧光的光学传感策略在外泌体POCT中展现出显著的临床应用潜力。

比色传感因结果直观、无需复杂仪器,是外泌体POCT的主要模式。以胶体金(Gold nanoparticles,AuNPs)[27]、彩色微球[28]及人工合成纳米酶(Nanozymes)[29]为代表的标记材料,因操作简便、成本低廉及结果可直接肉眼判读等优势,进一步拓展了比色策略的应用场景。

然而,传统比色传感的灵敏度常受限于标记探针有限的消光系数,为此,引入具有高效催化性能或级联放大能力的信号策略成为突破性能瓶颈的关键。纳米酶催化放大通过模拟酶活性实现信号转换,展现出极佳的稳定性与催化效率。Xu等[30]报道了一种基于MnO2/CeO2异质结纳米酶的纸基比色传感器(图1a),将传统试纸条的简便性与微流控芯片的高集成度相结合,用于肺癌血浆外泌体的可视化分层筛查。该策略利用MnO2/CeO2异质结界面的电子转移增强类过氧化物酶活性,并通过壳聚糖修饰的纤维素基底共价固定外泌体特异性适配体,以及抗CD63、抗纤维蛋白原γ链(Fibrinogen gamma chain,FGG)和抗纤维蛋白原β链(Fibrinogen beta chain,FGB)抗体,实现外泌体通用标志物与肺癌相关蛋白的联合捕获。此类多靶标识别模式可在确认囊泡身份的同时增强肿瘤来源判别能力,有助于降低复杂血浆样本中的假阳性风险。结合智能手机色相-饱和度-明度(Hue-saturation-value,HSV)颜色空间分析系统,该平台可在15 min内完成现场快速筛查,线性范围为102～108 particles/mL,检测限低至约2000 particles/mL。针对疑似高危样本,进一步采用酶标仪定量验证,并基于CD63、FGG、FGB的吸光度值构建逻辑回归模型,在194例临床血浆样本中区分良恶性肺结节的受试者工作特征曲线下面积(Area under the receiver operating characteristic curve,AUC)达0.996(灵敏度98.51%,特异性95.52%)。该工作将异质结纳米酶催化、纸基微流控、智能手机成像与机器学习相融合,为基层医疗提供了一种低成本、可扩展的液体活检策略。

除了材料层面的催化创新,基于生物化学反应的级联放大也是提升比色灵敏度的重要途径。Kong等[31]基于酪胺信号放大(Tyramide signal amplification,TSA)技术构建了一种金纳米粒子(AuNPs)比色适配体传感器(图1b),用于肿瘤外泌体的超灵敏可视化检测。TSA是一种基于辣根过氧化物酶催化的原位信号放大策略,其基本原理是在辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化下使酪胺分子形成短寿命自由基,并共价沉积在靶标邻近区域,从而在外泌体膜蛋白表面富集大量信号分子,实现局部信号增强。该策略以核仁素适配体修饰的磁珠(MNPs-Apt)特异性捕获核仁素阳性外泌体,随后借助TSA反应在捕获的外泌体膜蛋白上大量沉积生物素化酪胺(Bio-TR);进一步引入链霉亲和素-辣根过氧化物酶共修饰的金纳米粒子(AuNPs-Str-HRP),通过生物素-链霉亲和素相互作用实现多级信号放大;最终在HRP催化下使3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)底物产生肉眼可见的颜色变化。该方法检测限低至6300 particles/mL,成功实现了癌症患者与健康对照组的有效区分。

未来比色传感的发展将依赖于多信号放大策略的协同集成及人工智能辅助的智能化判读,以进一步突破灵敏度检测极限并增强临床适用性。

荧光生物传感器通常以荧光团、有机染料或量子点、上转换纳米颗粒等荧光纳米粒子作为信号报告元件[32-34],凭借高灵敏度、快速响应及优异特异性,已成为外泌体定量分析的重要技术平台。近年来,研究者将适配体、抗体等识别元件与荧光共振能量转移(FRET)、聚集诱导发光(AIE)、酶催化循环放大等信号增强策略相结合。其中,AIE是指某些荧光分子在溶液分散状态下发光较弱,而在聚集状态下由于分子内运动受限而产生显著荧光增强的现象,适合用于构建低背景、高信噪比的外泌体荧光检测体系。基于此类技术构建了系列荧光传感体系,实现了外泌体膜蛋白标志物(如PD-L1、CD81、EpCAM)及核酸(miRNA、lncRNA)的高灵敏检测[35]。

在信号放大策略方面,He等[36]报道了一种基于平行滚环扩增(RCA)的便携式适配体传感器(图2a),用于肿瘤源性外泌体的免分离、免标记荧光定量检测。该策略以肺癌外泌体表面MUC1和PD-L1为双靶标,这种双靶标设计在功能上类似于“AND”逻辑门,只有当外泌体同时携带肿瘤相关膜蛋白信号时才产生有效响应,从而提高对肿瘤源性外泌体的识别特异性。当外泌体存在时,适配体-靶标结合抑制RCA启动,进而影响量子点与亚甲基蓝的荧光信号。该方法检测限低至300 particles/mL,线性范围102～108 particles/mL。在40例临床血浆样本中特异性达93%、灵敏度达92%、AUC达0.956,结果与计算机断层扫描(CT)及病理诊断高度一致。除酶促扩增策略外,基于DNA纳米机器的非酶促信号放大路径展现出独特的技术优势。Liu等[34]报道了一种基于三维双DNA步行器纳米探针(D-DWN)的荧光传感器,用于乳腺癌来源EVs的高灵敏检测(图2b)。该策略利用EpCAM适配体修饰的磁珠捕获乳腺癌来源EVs,释放的单链DNA在核酸外切酶Ⅲ驱动下于金纳米颗粒表面自主行走,周期性切割荧光标记链以释放信号。双链同步行走显著提升了反应动力学,20 min内即可达到反应平台期。该方法检测限低至1180 particles/mL,在24例乳腺癌患者与24例健康对照中AUC达1.000,并可有效区分肿瘤级别及分子亚型(如Luminal B与三阴性乳腺癌)。

将小型化荧光检测模块与便携式终端集成,并结合长效荧光探针与多重编码技术,是实现“样本进-结果出”的全自动荧光POCT关键,这类集成化平台有望推动外泌体检测从实验室走向临床,实现肿瘤的早期筛查与全病程动态监测。

2.1.3 表面增强拉曼散射(SERS)传感

肿瘤外泌体临床检测对灵敏度要求逐渐提高,传统比色法与荧光法在极低丰度标志物检测及复杂生物背景干扰下存在灵敏度瓶颈。表面增强拉曼散射(SERS)技术通过贵金属纳米结构的局域表面等离激元共振(LSPR)效应,可显著放大分子拉曼散射信号[37,38]。相较于其他光学检测手段,SERS具有三项核心优势:谱峰极窄(半峰全宽通常较荧光窄1～2个数量级),有效规避光谱重叠;抗光漂白性能优异,适用长时间动态监测;以及分子特异性的“指纹光谱”识别能力,无需额外标记即可实现精准鉴定。上述特性使SERS在超灵敏分析及多重标志物同步检测方面展现出显著应用潜力[39]。

目前,基于SERS的外泌体POCT策略主要可分为两类:一是基于生物指纹图谱的无标记整体筛查,该策略利用外泌体自身组分(如膜蛋白、脂质及核酸)产生的内源性拉曼信号,构建反映疾病特征的“指纹光谱”。Lu等[40]通过金纳米颗粒负载的细菌纤维素膜(BC/AuNPs-film)作为SERS增强基底捕获血浆外泌体,结合一维卷积神经网络(1D-CNN)与支持向量机(SVM)算法,实现了早期肺原位腺癌(AIS)的高效判别(图3a),AUC达到0.84,灵敏度与特异性均为83.3%。该方法无需复杂预标记,在大规模癌症早期筛查中具有独特优势。二是基于SERS标签的特异性多重定量检测。利用SERS谱峰互不干扰的特性,可实现对肿瘤标志物的精准多重定量。Chen等[41]基于集成七通道平行微流控芯片的SERS平台(SMMEV),在单一芯片内通过对CD81、CD9、EpCAM、EGFR、CD24及CA125这6种标志物的同时捕获与检测,实现了对血清小细胞外囊泡(sEVs)的多重表型分析(图3b)。该方法可精准区分早期卵巢癌患者与健康患者,AUC值达0.9467,检测限低至10 particles/mL,性能显著优于传统酶联免疫吸附测定(ELISA)。

同时为满足POCT“现场、快速”的核心需求,SERS传感系统正朝着集成化与便携化方向转型。Teng等[42]将滚环扩增(RCA)与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)系统集成于便携式拉曼光谱仪平台,在无需复杂设备的情况下实现了对外泌体miRNA-21的单碱基分辨率检测,检测限低至0.62 amol/L,全程2 h内完成,SERS测量仅需1 s。Zheng等[43]开发的基于Fe3O4@TiO2磁性分离与Ag@NTP@TiO2 SERS标签的免抗体检测平台,从捕获到定量检测仅需10 min,检测限为640 particles/mL,并可兼容手持式拉曼光谱仪,充分体现了POCT所需的快速、便捷与低成本优势。

尽管SERS基底的均一性与成本控制仍有待优化,但其在超灵敏光学传感及液体活检精密化方面的独特优势,正使其成为外泌体POCT领域最具潜力的研究方向之一。

2.2 基于电化学传感的外泌体POCT

电化学生物传感器通过将生物分子识别事件转化为电流、电位及阻抗等可量化的电信号,具有灵敏度高、响应迅速和易于小型化的天然优势。近年来,电化学传感策略在外泌体检测中呈现出无标记型与标记型双轨并进的发展格局。无标记型传感以电化学阻抗谱(EIS)为代表,Zou等[44]基于同型细胞膜仿生界面构建了电化学微流控平台,用于乳腺癌来源EVs的亚型特异性检测(图4a)。该策略以不同亚型乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、BT-474)膜包被金基底,构筑同型识别界面,选择性捕获同源肿瘤EVs,通过EIS实现膜蛋白标志物的无标记检测。基于该策略的四通道微流控芯片在141例临床血浆样本中并行区分雌激素受体阳性(ER+)、HER2+及三阴性乳腺癌亚型,AUC达1.000,为肿瘤来源EVs亚型分析提供了免抗体修饰、高选择性的POCT新策略。

标记型传感则依赖氧化还原探针或纳米材料介导的信号放大,如基于二茂铁(Fc)或亚甲基蓝(MB)标记的适配体传感器,通过差分脉冲伏安法(DPV)或方波伏安法(SWV)实现miRNA、circRNA的fmol/L级定量。Wang等[45]基于MB染色的单链DNA适配体SYL3C,构建了一种准无试剂型电化学适配体传感器用于EpCAM阳性外泌体检测(图4b)。该传感器利用SYL3C单链上未配对的鸟嘌呤碱基与MB特异性结合,产生强电化学信号;当适配体与EpCAM阳性外泌体结合后,适配体发生构象转变,一方面降低鸟嘌呤对MB的可及性(减少MB积累),另一方面阻碍结合态MB向金电极的电子传递,两者共同导致电化学信号显著下降。该方法无需外加信号放大策略,检测限低至234 particles/mL,成功区分了非小细胞肺癌患者与健康个体的血清样本。

此外,场效应晶体管(FET)传感器的引入开辟了全固态检测路径。Zhao等[46]提出了一种基于In2O3纳米带的FET生物传感器,通过一步法表面功能化和肽核酸探针介导的夹心结构结合脲酶放大策略,实现了对循环外泌体miRNA的amol/L级超灵敏检测。该平台在缓冲液和患者血浆来源的外泌体裂解液中均表现出优异的灵敏度和特异性,突破了传统电化学方法对氧化还原介质的依赖。

可以预见,随着二维材料、有机电化学晶体管与自供能体系的融入,电化学外泌体POCT将向着全固态、免试剂、实时动态监测的方向持续演进,未来通过与柔性电子和无线传输模块集成,有望开启可穿戴式外泌体即时监测的新篇章。

2.3 基于微流控芯片的“采样-检测”一体化POCT系统

微流控技术通过对微升尺度(μL级)流体的精确操控,为实现外泌体“样本进-结果出”(Sample-to-answer)的全流程POCT提供了核心平台。针对临床样本中外泌体丰度极低且背景干扰复杂的双重瓶颈,微流控芯片在分离富集与集成传感方面发挥关键作用。

在分离富集模块,基于粒径差异的物理分离策略——包括微柱阵列或纳米级微孔滤膜构成的尺寸排阻单元(SEC)[47],以及利用规则微柱阵列调控不同尺寸颗粒在层流中的迁移路径,使较大颗粒发生侧向偏移、较小颗粒沿原流线通过的确定性侧向位移(DLD)[48,49]微结构——可实现外泌体与血细胞、大分子蛋白等干扰组分的快速筛分或连续流分选;磁性纳米探针辅助策略则通过表面功能化磁珠的特异性捕获与外加磁场定向迁移,实现目标物的洗涤、浓缩及基质背景干扰的显著降低[50]。

除上述方法外,声流控和黏弹性微流控也为外泌体的无标记连续分离提供了新的技术路径。声流控系统利用声场产生的声辐射力和声流效应,根据颗粒尺寸、密度及可压缩性差异调控其迁移轨迹,具有非接触、低剪切和生物相容性较好等特点,可与微流控芯片集成实现血细胞去除及细胞外囊泡亚群分选[50]。然而,纳米尺度外泌体所受声辐射力相对较弱,通常需要通过提高声场频率、优化通道结构或与其他富集模块耦合以提高分离效率。黏弹性微流控则通过在非牛顿流体中引入弹性升力,使不同尺寸颗粒在弹性力与流体阻力共同作用下产生不同的横向迁移速度或平衡位置,从而实现连续、无标记的尺寸分选[51]。该方法具有样本消耗量低和操作流程简单等优势,但分离性能易受聚合物浓度、流速、通道结构及样本黏度影响。未来将声流控或黏弹性分选模块与免疫亲和捕获及光学、电化学读出单元结合,有望进一步提升外泌体POCT系统的自动化程度和复杂样本处理能力。

在检测集成方面,精密流道布局与微阀泵系统推动了预处理模块与光学或电化学传感单元的无缝耦合,构建自动化“洗涤—结合—响应”闭环系统,规避传统离心提纯的繁琐操作与样本损耗,并通过对微环境(流速、温度、反应时间)的精准控制提升分析重现性[51-53]。

近年来,多模块深度集成与人工智能算法的融合为微流控外泌体POCT系统开辟了新方向。Lu等[54]报道了一种基于YOLO v8深度学习的集成化微流控分析系统(图5a),将片上免疫分离、量子点标记与自动图像识别集成于厘米级芯片,无需离芯片预处理,检测限低至8650 particles/mL,4种肿瘤细胞系标志物平行分析结果与血清学检测高度一致。Zhao等[55]构建了全集成离心微流控芯片iExoDisc,该芯片集血浆分离、高丰度蛋白去除和纳米孔膜过滤模块于一体,可在45 min内直接从400 μL全血中自动化分离外泌体,纯度较超速离心和聚乙二醇(PEG)沉淀法提高3～6倍,回收率达74.7%(图5b)。此类设计将微流控分离、智能传感与终端算法深度融合,正推动外泌体POCT从半定量筛查向全自动、高精度临床决策辅助系统跃升。

2.4 基于纸基的外泌体POCT

纸基分析器件(Paper-based analytical devices,PADs)凭借成本低廉、生物相容性优异以及无需外置驱动装置的毛细管自输运特性,已成为外泌体POCT领域的重要硬件载体[56-58]。其中,侧流层析试纸条(LFA)作为PADs的经典结构,通过在硝酸纤维素膜上预设检测线(T线)与质控线(C线),实现了对外泌体表面特定蛋白的快速免疫与可视化读出[59]。然而,传统比色LFA受限于标记物光学信号强度不足,其检测灵敏度往往难以满足低丰度外泌体的定量需求,且无法实现精准定量分析。

为此,研究者在LFA平台上相继整合了荧光标记、表面增强拉曼散射探针等多元信号转导策略,推动检测性能由初步定性筛查向高灵敏定量分析跨越。在荧光信号转导方面,荧光侧流层析(fLFA)平台通过集成量子点、上转换纳米颗粒等高性能荧光纳米标记,显著提升了信噪比与检测灵敏度,有效弥补了传统比色模式的性能缺陷。Kim等[60]构建了基于多量子点嵌入二氧化硅纳米颗粒(M-QD-SNs)的fLFA平台,用于外泌体高灵敏快速定量检测。该纳米颗粒尺寸均一,荧光强度较单量子点提高约300倍;表面共价偶联抗CD63抗体作为信号探针,与检测线预包被的CD63抗体协同捕获外泌体。层析10 min后,以便携式荧光读条仪读取信号。该方法检测限低至105 particles/mL,灵敏度较传统比色LFA提高了一个数量级,且具有优异的抗基质干扰能力。该技术操作简便、无需复杂设备,为外泌体POCT提供了高灵敏、定量化的检测策略。在SERS信号转导方面,SERS与LFA的结合同样突破了传统试纸条灵敏度不足与无法定量的局限。Su等[61]构建了一种基于表面增强拉曼散射-侧向层析试纸条(SERS-LFS)的生物传感器,实现了血清外泌体的多指标绝对定量。该策略利用金纳米星为基底制备光谱可区分的HER2与MUC1探针,在试纸条检测线处形成夹心复合物。结合便携式拉曼仪采集的光谱及多变量曲线分辨算法(MCR-ALS),该系统成功实现了对SKBR-3与MCF-7来源外泌体各自浓度的精准解混与定量。临床验证表明,该技术能有效识别不同分子亚型的乳腺癌并监测术后水平波动,为肿瘤的即时精准分型及全病程监测提供了新型检测范式[62]。

为了克服传统一维LFA在多步反应时序控制及样本预处理方面的固有局限,三维纸基微流控芯片(3D-μPADs)应运而生。此类平台利用纸张的叠层组装或疏水蜡打印图案化技术,构建三维流体网络,可在无需昂贵微泵的条件下,实现外泌体的手动顺序分离、多步骤洗涤及多靶标空间分辨检测。相比传统单检测线LFA,空间编码纸基芯片和多通道微流控纸基器件更适合开展多靶点联合分析。通过在不同检测区域预固定多种抗体或适配体,纸基平台可在同一样本中同步检测外泌体通用膜蛋白、肿瘤相关膜蛋白及外泌体内源性核酸信号,实现蛋白-核酸层面的正交验证。该设计不仅提升了对外泌体异质性的解析能力,也有助于降低单一标志物检测造成的假阳性。Wen等[63]构建了集成化纸基分析装置sEVpp-PAD,以MOF(UiO-66-NH2)修饰的适配体捕获纸片为核心,配合多通道芯片与注射器驱动的流路控制,可在1.8 h内直接从细胞培养基或血清中完成外泌体膜蛋白谱的分离与检测,检测限为2.18×106 particles/mL,单次装置成本仅2美元,检测试剂耗材较传统ELISA成本降低约20倍,且无需超速离心或抗体(图6a)。Hu等[64]设计了纸/聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)混合微流控装置,通过微阀控设计(手动调节螺丝改变纸张孔径与渗透性)实现流速控制(图6b)。该装置集成了免疫亲和区用于外泌体捕获,以及溶胶、凝胶二氧化硅涂层区用于miRNA提取,结合纸基ELISA实现外泌体定量检测,检测限为6×107 particles/mL,并通过RT-qPCR验证提取miR-21的Ct值与商品化试剂盒相当,展现了在POCT场景中外泌体分离与核酸分析的应用潜力。

此外,纸基平台在检测稳定性与数字化结合方面也取得了显著进展。Pallarès-rusi width=8,height=11,dpi=110

ol等[65]发展了纸基垂直流免疫分析(VFA),采用ELISA类似格式,以碱性磷酸酶(ALP)标记二抗催化氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(NBT/BCIP)底物产生不溶性靛蓝沉淀,在硝酸纤维素膜上实现外泌体表面蛋白(CD9、CD63、CD81、EGFR)的可视化检测。该检测依靠毛细作用与重力驱动,无需外置微泵,可在15 min内完成,检测限约6×107 particles/mL,并通过智能手机成像实现半定量分析。

结合智能手机成像分析或手持式信号读取终端,纸基POCT系统正在构建一个从“样本采集”到“结果云端分析”的闭环。综上所述,作为微流控技术的简化与普及形式,纸基平台不仅降低了液体活检的门槛,更为资源匮乏地区的肿瘤早筛提供了切实可行的技术支撑。

由表2可知,外泌体POCT的性能提升主要体现在信号转导机制优化与平台集成能力增强两个层面。比色、荧光、SERS和电化学传感侧重于提高识别灵敏度、信号放大效率和定量能力,其中比色传感更适合低成本初筛,荧光、电化学和SERS传感更适合低丰度标志物检测及多标志物分析。微流控芯片和纸基器件则主要承担样本预处理、外泌体富集、反应控制和便携化读出的集成功能,是推动外泌体POCT向“样本进-结果出”应用转化的重要载体。

上述传感策略虽在分析性能上已取得显著进展,但其临床转化效能最终仍取决于在真实肿瘤场景中的适配与验证。不同癌种的外泌体在来源细胞、分子组成、体液分布特征及临床检测需求上存在显著差异。因此,脱离具体癌种谈技术性能易陷入“实验室理想化”困境,唯有将传感技术与肿瘤临床需求深度耦合,方能评估其真实诊断价值与转化潜力。以下将按癌种分类,系统阐述外泌体POCT技术在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及胃癌等恶性肿瘤诊断中的具体应用范式,重点剖析各平台如何针对癌种特异性标志物与临床场景进行定制化设计,并比较其验证规模、诊断效能及向床旁转化所面临的差异化挑战。

3 外泌体POCT在不同癌症诊断中的应用

3.1 乳腺癌

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤,2022年全球新发病例达229.7万例,占女性癌症总数的23.8%[1]。其早期筛查与分子亚型精准分型对改善患者预后至关重要。然而,传统乳腺靶向超声检查在致密型乳腺组织中灵敏度可降至48%～62%,早期病变漏诊风险依然显著[66]。肿瘤源性外泌体作为非侵入性液体活检标志物,携带的miR-21、miR-155等miRNA及HER2、EpCAM等膜蛋白反映肿瘤生物学行为,为早期识别提供了分子窗口[67]。

基于电化学传感、微流控等技术,研究者构建了多种外泌体POCT平台。Zhang等[68]基于三维方向杂交链式反应(HCR)调控Cu2+@DNA纳米球,建立了一步法均相电化学传感器。EpCAM适配体特异性识别靶标后破坏DNA纳米球完整性,释放游离Cu2+产生电化学信号。该方法检测限为30 particles/mL,在32例乳腺癌患者与12例健康对照中准确率和特异性均超过90%,评估腋窝淋巴结转移的准确率达88%。Zhang等[69]开发了集成泪液采集、外泌体富集与检测于一体的光学生物芯片,仅需14 μL泪液,采用双标志物适配体夹心复合物及声辐射富集策略,检测限低至1.2×102 particles/mL,检测时间约10 min。在临床泪液样本中首次实现乳腺癌外泌体检测,以100%的灵敏度和特异性区分患者与健康供体。Lan等[70]报道了基于介电泳的微流控芯片,填充透明抗体偶联微珠,通过介电泳富集外泌体并联合免疫亲和捕获,有效解决了外泌体低密度、小尺寸导致的富集和检测难题。

展望未来,乳腺癌外泌体POCT有望进一步整合于可穿戴汗液或泪液分析装置,实现院外动态监测;同时,基于单外泌体组学与多模态生物传感的分子分型模型,将为个体化治疗决策提供实时指引。

3.2 肺癌

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,2022年全球新发病例约248万例,死亡病例约182万例。其核心瓶颈在于早期诊断窗口缺失——超过75%患者确诊时已属晚期(Ⅲ/Ⅳ期),错失手术根治时机[1,71]。低剂量螺旋CT(LDCT)虽为目前有效的筛查手段,但假阳性率高达24.2%,阳性预测值仅约4%,这可能导致大量良性结节患者接受不必要的穿刺活检或手术,加重医疗负担与心理焦虑[72]。

肺癌外泌体标志物呈现组织特异性与功能异质性的双重特征。在膜蛋白层面,表皮生长因子受体(EGFR)突变蛋白可用于预测靶向治疗响应,程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)表达水平与免疫检查点抑制剂疗效密切相关;CD63、CD81等4次跨膜蛋白家族成员则作为外泌体身份标签,保障标志物溯源的可靠性[73]。在核酸层面,研究重心已从线性miRNA拓展至环状RNA(circRNA)——其闭合环状结构赋予的核酸外切酶抗性,显著提升了体液检测的稳定性。其中,circHIPK3在非小细胞肺癌(NSCLC)外泌体中呈显著高表达,通过竞争性吸附miR-107解除对脑源性神经营养因子(BDNF)的抑制,协同促进肿瘤细胞增殖、迁移与耐药形成[74]。

基于上述标志物,研究者开发了系列肺癌外泌体POCT平台。在化学发光传感方面,Zheng等[75]报道了一种基于g-C3N4@AgNPs双功能纳米片的化学发光免疫传感器,用于PD-L1阳性外泌体的超灵敏检测及肺腺癌亚型分类。该策略首先合成了L012钠盐发光试剂和Co2+双功能化的g-C3N4@AgNPs纳米片(简称GALC),其作用机制为:g-C3N4富集大量L012化学发光试剂,并协同Co2+催化H2O2产生羟基自由基(·OH),从而协同放大化学发光信号。在此基础上,将PD-L1抗体修饰于GALC表面(通过Ag-N键)作为化学发光免疫探针,同时以Fe3O4@TiO2纳米颗粒作为外泌体捕获平台(通过磷酸基团-TiO2配位作用)。构建的免疫传感器检测限低至28.1 particles/mL,线性范围为4.28×102～4.28×106 particles/mL。在50例血清样本的临床评估中,健康个体与微浸润性腺癌(MIA)患者之间、MIA与浸润性腺癌(IAC)患者之间的PD-L1阳性外泌体水平均存在极显著差异(P<0.0001),AUC达0.947,为肺腺癌术前无创亚型分类提供了高灵敏、高精度的检测方法。

在电化学传感方面,Yuan等[76]报道了一种基于金纳米岛微电极(AuNIME)的电化学微适配体传感器,用于EGFR阳性肺癌外泌体的定量检测。该传感器的核心创新在于:使用热退火法制备的金纳米岛微电极富含Au(111)晶面,具有高比表面积,显著增强适配体固定密度;再结合双适配体“AND”逻辑门识别策略(同时靶向EGFR和CD63)确保了超高的检测特异性;最后使用CdS量子点信号放大系统结合方波阳极溶出伏安法(SWASV)读出,实现了多级信号放大架构。该传感器检测限低至150 particles/mL,在血清加标样本中回收率达97.8%～105.0%,性能显著优于ELISA、NTA及近期报道的电化学外泌体检测方法,为NSCLC早期诊断和治疗实时监测提供了非侵入性工具。

随着液体活检进入临床指南,外泌体EGFR/PD-L1的POCT有望与影像组学及呼出气分析构成多模态早筛体系,并通过大规模前瞻性队列验证其卫生经济学价值,加快向基层医疗的部署。

3.3 结直肠癌

结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤,2022年新发约192.6万例,死亡约90.4万例。其发生发展受肠道微生态-肿瘤互作网络调控,外泌体标志物研究呈现独特的微环境依赖性[1]。结肠镜检查虽为诊断金标准,但存在穿孔风险,加之侵入性操作导致依从性低下,制约大规模筛查应用;粪便隐血试验无创,但对结直肠癌的敏感性约为82.3%,受出血间歇性影响,早期病变漏诊风险仍然存在[77,78]。肿瘤源性外泌体作为肠道微环境的远程信使,可稳定存在于血浆及粪便中,携带宿主-微生物互作的分子印记,为突破结肠镜可及性瓶颈与FOBT敏感性局限提供了替代路径。目前,结直肠癌外泌体POCT检测主要聚焦于血浆外泌体蛋白标志物(CEA、CA19-9、EpCAM)及粪便外泌体核酸标志物(miR-21、miR-92a)[79],技术路径涵盖电化学传感、荧光传感及微流控集成。

Bai等[80]运用三螺旋分子开关(THMS)结合Y型催化发夹组装(Y-CHA)反应,构建了一种智能手机辅助的比色传感器,用于PD-L1阳性外泌体的高灵敏便携检测。该方法通过THMS识别PD-L1+外泌体后释放触发链,启动Y-CHA循环形成带3个G-四链体末端的Y型DNA,在K+存在下形成DNAzyme催化TMB显色,结合智能手机图像分析实现定量。紫外检测限为5.45×103 particles/mL,智能手机检测限为8.56×103 particles/mL,该方法成功区分了结直肠癌肝转移患者与健康个体,为术后居家监测提供了高通量、多标志物POCT方案。Gramkow等[81]将血浆源性外泌体tRF-3004a与CEA及CA19-9联合检测,使AUC提升至0.867,彰显了多标志物组合策略的诊断增益。Chen等[82]结合金纳米阵列与CRISPR/Cas13a系统,利用适配体从血浆中选择性分离肿瘤源性外泌体,实现其中miRNA-21和miRNA-23a的高灵敏检测,为结直肠癌多靶标外泌体检测提供了集成化微流控方案。

对非侵入性粪便外泌体自检装置和肠道菌群-外泌体互作标志物的深度挖掘,将成为未来的重要突破方向,有望重塑结直肠癌的筛查路径与高危人群管理策略。

3.4 胃癌

胃癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤。2022年全球新发病例约96.8万例,我国新发病例约35.8万例,占全球比例约37%[1]。其临床沉默性特征显著——早期病变常无特异性症状,超过80%的患者确诊时已属局部晚期或转移期,错失根治性手术窗口[83]。加之侵入性操作引发的生理不适与心理抗拒导致筛查依从性低下,且内镜医师资源分布不均进一步制约其在基层医疗的可及性。基于外泌体的非侵入性POCT方案,通过捕获体液中胃黏膜微环境的远程分子印记,为突破胃镜可及性瓶颈、实现高危人群级联筛查提供了关键路径。

目前,胃癌外泌体标志物研究呈现病因-病变-进展的多维度关联特征。在膜蛋白层面,CD97[84]通过外泌体依赖方式激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,促进细胞增殖与淋巴转移,并与CD44剪接变体6(CD44v6)协同构建转移前微环境[85];上皮细胞黏附分子(EpCAM)表达水平与肿瘤分化程度相关。在核酸层面,miR-21通过靶向程序性细胞死亡因子4(PDCD4)、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)等抑癌基因抑制凋亡并促进上皮-间质转化(EMT),其血浆外泌体高表达与肿瘤分期及Lauren分型(肠型与弥漫型)密切相关[86]。尤为关键的是,幽门螺杆菌(Hp)感染诱导的外泌体PD-L1上调,不仅可作为癌前病变(慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生)恶性转化风险的预警指标,更为理解感染-肿瘤微环境重塑提供了动态监测窗口[87]。此类多维度标志物的整合检测,正推动胃癌筛查从单一形态学诊断向病因-风险-病变一体化评估的范式演进。

基于上述标志物,研究者开发了多种胃癌外泌体POCT检测平台。在miR-21检测方面,Cheng等[88]基于三链体介导链置换反应构建了无酶电化学传感器,通过催化发夹自组装(CHA)驱动的分子机器实现信号级联放大,在1 fmol/L～1 nmol/L线性范围内实现miR-21精准定量,检测限低至0.43 fmol/L,为早期胃癌筛查提供了高性能POCT方案。Huang等[89]开发了CHA驱动的SERS-纳米酶双功能传感器,以Au-Pt纳米粒子为信号探针、Fe3O4@SiO2为捕获探针,通过miR-21触发CHA组装赋予SERS增强能力并同步催化TMB-H2O2显色反应,miR-21检测限低至20.24 amol/L,在胃癌前病变临床样本中表现出优异的诊断准确性和临床应用价值。Li等[90]基于539例受试者的回顾性分析,证实血清外泌体miR-21是胃癌发生的独立危险因素(OR=3.477),单独诊断早期胃癌的AUC达0.772,联合CA72-4后AUC提升至0.927,为多标志物联合检测策略提供了大规模临床队列证据。在微流控集成方面,Mou等[91]开发了磁性可逆适配体微流控芯片(MRA-Chip)结合Zr-MOF电化学传感器,利用鱼骨状微结构增强传质效应,对胃癌来源sEVs的捕获效率较传统方法提高115%,配合Zr-MOF负载亚甲蓝实现免标记电化学检测,检测限低至6500 particles/mL,在临床样本中实现了癌症患者与健康个体的100%准确区分。上述工作将胃癌外泌体标志物研究与POCT技术深度融合,为胃癌早期筛查与高危人群分层管理提供了创新技术路径。后续亟待在幽门螺杆菌感染-癌前病变-早癌的多阶段纵向队列中,通过多标志物组学与机器学习构建动态风险预测模型,并借助低成本纸基或全集成微流控平台实现基层普及,最终助力胃癌死亡率的实质性下降。

4 总结与展望

肿瘤源性外泌体作为液体活检的重要候选标志物,在癌症早期筛查、分子分型及治疗响应监测中展现出潜在临床价值。本文从信号转导机制与平台集成载体两个维度,系统综述了外泌体POCT技术的研究进展。比色传感具有操作简便和结果可视化等优势,适合基层快速筛查;荧光、SERS及电化学传感借助核酸扩增、DNA纳米机器和纳米材料等信号放大策略,提高了低丰度外泌体及其分子标志物的检测能力,其中部分核酸检测达到fmol/L至amol/L量级;微流控芯片和纸基分析器件则通过整合样本预处理、外泌体富集、反应控制与便携化读出,为实现“样本进-结果出”的一体化检测提供了重要载体。现有平台已在乳腺癌、肺癌、结直肠癌和胃癌等临床样本中开展初步验证,部分研究表现出较高的诊断灵敏度和特异性,但其性能仍需通过标准化流程和大规模前瞻性临床研究进一步验证。然而,要将这些实验室突破真正转化为重塑肿瘤诊疗范式的力量,未来仍需在以下方向发力。第一,标准化与多中心临床验证。当前研究多为单中心、小样本回顾性分析,亟需建立外泌体分离、富集与信号定量的国际标准,并开展跨区域、多中心的前瞻性临床试验,在癌前病变-早癌-进展期多阶段纵向队列中验证其转化价值。第二,多模态信号融合与智能决策。未来POCT平台应同时集成比色、荧光、电化学乃至SERS等多种传感模式,实现同一芯片上蛋白质、核酸、代谢物的并行检测,并结合迁移学习、大语言模型解析多模态数据,构建从分子分型到治疗推荐的闭环决策工具。第三,可穿戴与居家检测生态。柔性电子、自供能系统及汗液/泪液/唾液等非侵入性采样界面将推动外泌体POCT从院内走向日常生活,通过无线传输与云端分析,实现肿瘤高危人群的动态监测与实时预警。第四,单外泌体组学与新型标志物发现。随着单囊泡测序和空间外泌体组学的发展,传统线性miRNA与膜蛋白之外的功能性circRNA、翻译后修饰蛋白以及微生物源性外泌体分子将大大拓展可检测靶标空间,使得泛癌早筛、器官定位和微环境解析成为可能。

总之,外泌体POCT正处在从技术积累向临床爆发的关键拐点。外泌体POCT将深度赋能肿瘤预防、诊断、治疗与康复的全生命周期管理,有力推动精准肿瘤学关口前移,为全球癌症控制提供变革性技术方案。

[1]Filho A M,Laversanne M,Ferlay J,Colombet M,Pi width=8,height=8,dpi=110

eros M,Znaor A,Parkin D M,Soerjomataram I,Bray F．Int．J．Cancer,2025,156(7):1336-1346．

[2]Wagle N S,Nogueira L,Devasia T P,Mariotto A B,Yabroff K R,Islami F,Jemal A,Alteri R,Ganz P A,Siegel R L．CA A Cancer J．Clin．,2025,75(4):308-340．

[3]Neagu A N,Bruno P S,Josan C L,Waterman N,Morrissiey H,Njoku V T,Darie C C．Proteomes,2025,13(4):47．

[4]Kalluri R,Lebleu V S．Science,2020,367(6478):eaau6977．

[5]Hsu C C,Wu Y．Exp．Biol．Med．,2022,247(23):2152-2172．

[6]Prabhu S N,Liu G．Biosensors,2025,15(8):511．

[7]Hao X Y,Liu Z H,Ma F F,Li T,Liu C B,Wang N,Guan J B,He N N,Liu J,Lu S J,Song H J,Li J G,Wen K X．Dose-Response,2025,23(2):1526094432．

[8]Verma N,Arora S．Pharmaceutics,2025,17(8):990．

[9]Doyle L,Wang M．Cells,2019,8(7):727．

[10]Lone S N,Nisar S,Masoodi T,Singh M,Rizwan A,Hashem S,El-rifai W,Bedognetti D,Batra S K,Haris M,Bhat A A,Macha M A．Mol．Cancer,2022,21(1):79．

[11]Gulei D A,Irimie A I,Cojocneanu-petric R,Schultze J L,Berindan-neagoe I．Bioconjugate Chem．,2018,29(3):635-648．

[12]Khan A,Raza F,He N Y．Micromachines,2024,15(10):1181．

[13]Lawrence S R,Shah K M．Biology,2024,13(9):694．

[14]Li J L,Wang A L,Guo H J,Zheng W,Chen R,Miao C F,Zheng D D,Peng J,Wang J C,Chen Z G．Theranostics,2025,15(11):5277-5311．

[15]Gorgzadeh A,Nazari A,Ismaeel A,Safarzadeh D,Hassan J A K,Mohammadzadehsaliani S,Kheradjoo H,Yasamineh P,Yasamineh S．Virol．J．,2024,21(1):34．

[16]Azimian Z V,Eslampoor N,Panahi-alanagh S,Malekmohammad L,Stanek A．Front．Pharmacol．,2026,17：1762630．

[17]Escudero-cernuda S,Eiro N,Fraile M,Vizoso F J,Fern width=8,height=11,dpi=110

ndez-colomer B,Fern width=8,height=11,dpi=110

ndez-s

nchez M L．Mikrochim．Acta,2025,192(5):311．

[18]Liu H Z,Zhou Y Y,Chang W W,Zhao X L,Hu X J,Koh K,Chen H X．Biosens．Bioelectron．,2024,262：116527．

[19]Zhang Q D,Wang H Z,Liu Q Y,Zeng N,Fu G,Qiu Y X,Yang Y P,Yuan H W,Wang W,Li B．Int．J．Nanomed．,2024,19：1923-1949．

[20]Li Q,Ding Y N,Shi Y J,Qiu C,Lei L,Li S L,Zhu Z,Zheng J D,Qin C,Wang K Y,Jiang C,Han Z Y,Yang L Y,Zhang L,Li P,Tong L J,Wang D,Xu H,Dai B Y,Du Y Y,Wang K Y,Fan Z J,Wang W,Guo K Y,Huang Y,Wang X,Sui B D,Wen L,Chen F X,Feng D C,Qin X,Mao W J,Liu H X,Liu C,Li Z T,Wang Y F,Huang R,Lu R,Zhang Y L,Tian Y,Miao X L,Yin Y,Zhang J,Wang Z Z,Ma T,Dong H F,Wei D X,Yang Z Y,Yang X H,Cheng X Y,Chrzanowski W,Chang Z G,Zhang X D,Cho W C,Luo Y,Xia W L,Huang Z H．Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids．,2026,7(1):165-233．

[21]Shi J．J．Clin．Med．,2016,5(4):42．

[22]Alt

nta

Ö,Saylan Y．Anal．Chem．,2023,95(44):16029-16048．

[23]Dilsiz N．Transl．Oncol．,2024,50：102121．

[24]Han J Y,Liu S Q,Wang Z,Wu Y F．TrAC Trends Anal．Chem．,2022,157：116799．

[25]Akdeniz M,Al-shaebi Z,Aydin O．Adv．Intell．Discov．,2025:202500040．

[26]Lee S,Moussa N A M,Kang S H．Nanomaterials,2025,15(15):1153．

[27]Wang Z X,Zou R B,Yi J H,Wang Y D,Hu H,Qi C,Lai W H,Guo Y R,Xianyu Y L．Small,2024,20(29):2310869．

[28]Song Y T,Lu X D,Chen P F,Huang G L,Li Y,Wang Z P,Yang J S．Chem．Eng．J．,2025,523：168763．

[29]Li Z H,Liu X C,Wang D,Zhang Z L,Chen G,Yu Z L,Tian Z Q．Anal．Methods,2024,16(31):5403-5411．

[30]Xu X,Ying T,Yang Z H,Zhang Z,Hu L,Shen T,Li D J,Zhu R,Chang D．Talanta,2026,297：128714．

[31]Kong X M,Li C,Li Y,Song X Q,Huang L．Analyst,2025,150(8):1670-1678．

[32]Wu Y T,Deng W T,Klinke D J．Analyst,2015,140(19):6631-6642．

[33]Akinlalu A,Rasuleva K,Ogberefor E,Gao T,Han H Y,Singh P K,Lieu C H,Coughlan C,Pitts T M,Sun D L．ACS Nano,2025,19(50):42056-42065．

[34]Liu Q Y,Zhang Q D,Zhang R Y,Wen Z C,Yao Z J,Li B,Yang Z,Hu J H,Wang W,Wang H Z,Peng C Y．Sens．Actuat．B Chem．,2025,433：137578．

[35]Jiang J,Kan X W．Biosens．Bioelectron．,2025,286：117644．

[36]He Y Q,Zeng X H,Xiong Y,Shen C C,Huang K,Chen P P．Adv．Sci．,2024,11(32):2403371．

[37]Francavilla A,Turoczi S,Tarallo S,Vodicka P,Pardini B,Naccarati A．Mutagenesis,2020,35(3):243-260．

[38]Lu Y,Qin H,Zhang W．Anal．Sci．,2026,42(5):299-312．

[39]Fan R,Chen S T,Lan F,Li W B,Zhu Y T,Zhang L F,Zhang Y,Li L．Anal．Chim．Acta,2025,1336：343264．

[40]Lu D C,Shangguan Z K,Su Z H,Lin C,Huang Z F,Xie H H．Anal．Bioanal．Chem．,2024,416(23):5089-5096．

[41]Chen X Y,Tang J S,Zhao Y Y,Wang R,Sang S G,Yu F B,Xing Y L．Biosens．Bioelectron．,2025,267：116724．

[42]Teng J L,Chen Y P,Zhang W W,Xu H T,Ke L F,Xu H,Wang J．Anal．Chem．,2025,97(38):21098-21105．

[43]Zheng S H,Su N,Zhang R,Chen X F,Zhang J,Gao M X,Zhang X M．Anal．Chem．,2025,97(11):6320-6328．

[44]Zou Z H,Jin X,Yu X M,Li L J,Pan Y,Zhou G Z,Wang Z Y,Cao Y,Zhao J．Nat．Commun．,2026,17(1):1953．

[45]Wang Y H,Jie H,Ye H J,Zhang Y Y,Li N,Zhuang J Y．Anal．Chem．,2023,95(49):18166-18173．

[46]Zhao Z Y,Mallon K,Chen M R,Cui D Z,Tian F G,Albawardi S,Alsaggaf S,Amer M R,Watson M A,White M A,Cote R J,Thompson M E,Zhou C W．ACS Nano,2025,19(32):29726-29736．

[47]Liu W Z,Ma Z J,Kang X W．Anal．Bioanal．Chem．,2022,414(24):7123-7141．

[48]Hsieh K Y,Smith J T,Kim S C,Gifford S M,Pereira M,Chen G Y,Wunsch B H．Lab on a Chip,2025,25(9):2148-2156．

[49]Jiang B,Li L,Zhou M,Li Y,Luo K,Yang X,Chen D．Phys．Fluids,2025,37(7):073382．

[50]Wu M X,Ouyang Y S,Wang Z Y,Zhang R,Huang P H,Chen C Y,Li H,Li P,Quinn D,Dao M,Suresh S,Sadovsky Y,Huang T J．Proc．Natl．Acad．Sci．USA,2017,114(40):10584-10589．

[51]Hettiarachchi S,Ouyang L X,Cha H T,Hansen H H W B,An H,Nguyen N T,Zhang J．Nanoscale,2024,16(7):3560-3570．

[52]Contreras-naranjo J C,Wu H J,Ugaz V M．Lab on a Chip,2017,17(21):3558-3577．

[53]Wang J,Ma P,Kim D H,Liu B F,Demirci U．Nano Today,2021,37：101066．

[54]Lu Y X,Wang H H,Zeng Z,Hui J N,Ji J Y,Mao H J,Shi Q,Yang X Y．Talanta Open,2025,11：100398．

[55]Zhao X D,Liu X,Chen T C,Xie H,Li S J,Zhang Y,Zhang H W,Cao Y L,Du W,Feng X J,Liu X,Li Y W,Chen P,Li Q B,Liu B F．ACS Nano,2025,19(9):8948-8965．

[56]Wu Y,Wang Y,Lu Y,Luo X,Huang Y,Xie T,Pilarsky C,Dang Y,Zhang J．Micromachines,2022,13(10):1571．

[57]Ramnauth N,Neubarth E,Makler-disatham A,Sher M,Soini S,Merk V,Asghar W．Sensors,2023,23(19):8292．

[58]Wang B,Moyano A,Duque J M,S width=8,height=11,dpi=110

nchez L,García-santos G,Flórez L J G,Serrano-pertierra E,Blanco-lópez M D C．Biosensors,2022,12(7):490．

[59]Qiu S,Shen C,Jian X,Lu Y,Tong Z,Wu Z,Mao H,Zhao J．Chin．Chem．Lett．,2022,33(5):2701-2704．

[60]Kim H M,Oh C,An J,Baek S,Bock S,Kim J,Jung H S,Song H,Kim J W,Jo A,Kim D E,Rho W Y,Jang J Y,Cheon G J,Im H J,Jun B H．Nanomaterials,2021,11(3):768．

[61]Su X M,Xie Y,Liu X Y,Chen M Y,Zheng C,Zhong H,Li M．ACS Appl．Mater．Interf．,2023,15(31):37130-37142．

[62]Chen R,Chen X R,Zhou Y F,Lin T,Leng Y K,Huang X L,Xiong Y H．ACS Nano,2022,16(2):3351-3361．

[63]Wen S Q,Zhang L,Huang Z,Chen M,Xu Y Z,Huang X,Zhang Z,Zou X Y,Dai Z,Liu S Y．Chin．Chem．Lett．,2026,37(2):111333．

[64]Hu W P,Lai Y F,Vu C A,Tsao C W,Pan S C,Cheng C M,Chen W Y．Talanta,2023,265：124851．

[65]Pallarès-rusi width=8,height=8,dpi=110

ol A,Marfà J,Rossi R,Martí M,Pividori M I．Biosensors,2025,15(10):694．

[66]Pisano E D,Gatsonis C,Hendrick E,Yaffe M,Baum J K,Acharyya S,Conant E F,Fajardo L L,Bassett L,D′orsi C,Jong R,Rebner M．N Engl J．Med．,2005,353(17):1773-1783．

[67]Peng X,Mei X C,Liu X Y,Zhang G H,Li Y C．Anal．Chem．,2024,96(32):13252-13259．

[68]Zhang Z H,Hu R H,Fu D,Liu W J,Qu J,Wang Y,Zeng X H,Zhao X,Meng X Y,Qiu B X,Jiang X,Liu B F,Chen J,Chen P P．Chem．Eng．J．,2025,517：164315．

[69]Zhang S X,Liu J M,Li M M,Zeng Y J,Xu T L．Biosens．Bioelectron．,2025,282：117507．

[70]Lan M,Wu D,Cheng C,Ren Z,Chen S Y,Li Y L,Song Z X,Lu H L,Wang J X,Li G Y,Yang F．Anal．Chem．,2025,97(10):5678-5687．

[71]Li C,Lei S Y,Ding L,Xu Y,Wu X N,Wang H,Zhang Z J,Gao T,Zhang Y Q,Li L．Chin．Med．J．,2023,136(13):1583-1590．

[72]Eslami S Z,Cortés-hern width=8,height=11,dpi=110

ndez L E,Sinoquet L,Gauthier L,Vautrot V,Cayrefourcq L,Avoscan L,Jacot W,Pouderoux S,Viala M,Thomas Q D,Lamy P J,Quantin X,Gobbo J,Alix-panabières C．Br．J．Cancer,2024,130(1):63-72．

[73]Zhou T,Ma H,Li Z K,Xu Y J,Zhao L L．Front．Oncol．,2025,15：1599608．

[74]Hong W J,Zhang Y J,Ding J Y,Yang Q L,Xie H X,Gao X W．BioMed Res．Int．,2020,2020(1):6075902．

[75]Zheng K Y,Li D Y,Zhang R X,Zhang W C,Wang M L,Zheng T H,Wei X,Cui H．Anal．Chem．,2025,97(32):17833-17840．

[76]Yuan W X,Jiang S C,Mao C H,Jiang J R,Zhang K,Lin D M,Tang J J．J．Nanostruct．Chem．,2026,16(1):56-71．

[77]Méndez G,Rivera-matos L,Shuja A．BMJ Open Gastroenterol．,2025,12(1):e001876．

[78]Kindt I S,Martiny F H J,Gram E G,Bie A K L,Jauernik C P,Rahbek O J,Nielsen S B,Siersma V,Bang C W,Brodersen J B．PLoS One,2023,18(10):e0292797．

[79]Lu Y X,Ye L,Jian X Y,Yang D W,Zhang H W,Tong Z D,Wu Z H,Shi N,Han Y W,Mao H J．Biosens．Bioelectron．,2022,204：113879．

[80]Bai G,Fan Z C,Zhao X X,Dong Y,Tan C C,Bai L Y,Jiang H R,Liu T R,Li J J,Zhao X,Yu H．Biosens．Bioelectron．,2025,286：117592．

[81]Gramkow M H,Mosgaard C S,Schou J V,Nordvig E H,Dolin T G,Lykke J,Nielsen D L,Pfeiffer P,Qvortrup C,Yilmaz M K,Larsen O,Bojesen S E,Jensen B V,Johansen J S．Cancer Treat．Res．Commun．,2025,43：100907．

[82]Chen M Z,Choi H K,Goldston L L,Hou Y N,Jiang C P,Lee K B．ACS Nano,2025,19(35):31438-31456．

[83]Yang W J,Zhao H P,Yu Y,Wang J H,Guo L,Liu J Y,Pu J,Lv J．World J．Gastroenterol．,2023,29(16):2452-2468．

[84]Liu D R,Li C,Trojanowicz B,Li X W,Shi D K,Zhan C N,Wang Z F,Chen L．Gastric Cancer,2016,19(3):754-766．

[85]Lu W J,Li M H,Lamu D Z,Qian H,Liang Z F,Xu X Z．Front．Cell Dev．Biol．,2025,13：1560583．

[86]Wang C G,Bai M L,Liu X L,Li Z J,Wang H B,Guo S B．Front．Mol．Biosci．,2025,12：1697875．

[87]Liu S F,Zhang N,Ji X,Yang S Y,Zhao Z,Li P．Cell Death Dis．,2025,16(1):17．

[88]Cheng W T,Pan H,Chen J H,He M,Wang Z Y,Xiang Y．Anal．Chem．,2025,97(9):5244-5250．

[89]Huang Y,Zhuang Y W,Zhu M,Zhou Y F,Xu M W,Wang Z X,Zhu J W,Sheng J X．RSC Adv．,2026,16(4):3409-3419．

[90]Li C,Hong C,Zhou G,Chai Q,Hu J,Lv A,Fang W．Am．J．Transl．Res．,2026,18(2):1088-1102．

[91]Mou L H,Feng J Z,Ye M L,Guo Z Q,Hu X Y,Wu L L,Shu Y．Talanta,2026,302：129398．