在自然界中,绝大多数元素并非以单一原子形态存在,而是以同位素的形式广泛分布;根据同位素的定义,它们属于同一元素(质子数相同),彼此间的核心差异在于中子数不同。按有无放射性可分为放射性同位素与稳定同位素两类[1,2]。放射性同位素尽管在科研与临床中具有重要作用,却存在明显局限:其使用需依赖严格的防护设施,且废弃物(尤其是 3H和 14C)处理成本较高;此外,放射性标记试剂种类有限,检测灵敏度与半衰期成反比,导致高灵敏度实验往往需采用 32P等短半衰期核素[3]。与放射性同位素相比,稳定同位素如 13C、2H(D)、15N等因不具备放射性,在实验合成、样品制备及实际使用中更为安全便捷[1]。常见的稳定同位素还包括 13C、D、15N、17O、18O、33S、34S、37Cl和 81Br等。目前稳定同位素标记化合物已广泛应用在化学[4-10]、材料科学[11-13]、农业[14,15]、医学[16-20]、生物学[21,22]和环境科学[23-28]等多个学科领域。
同位素纯度是稳定同位素标记有机化合物的重要指标,对科学研究和应用具有重要意义,它直接或间接影响实验结果的准确性和可靠性[29]。使用高同位素纯度的化合物可以确保反应机制[30]以及物质追踪的精确性[31]。若同位素纯度不够高,可能会影响实验结果的准确性,甚至使研究得出错误的结论。
随着质谱(MS)技术的发展,越来越多新的同位素纯度分析方法应运而生。本文综述了MS技术与其他分析技术在同位素纯度分析领域的应用,比较了这些分析方法的优缺点及适用性,讨论了MS技术应用在同位素纯度分析中的挑战与关键问题,展望了MS技术在同位素纯度分析领域未来的发展趋势。
1 质谱(MS)技术在同位素纯度分析中的方法学进展
1.1 气相色谱-质谱(GC-MS)
气相色谱-质谱(GC-MS)在同位素纯度分析中应用广泛,特别适用于挥发性或半挥发性的小分子稳定同位素标记化合物的分析。气相色谱能够有效分离复杂样品中的不同挥发性成分,且与MS联用后,能够对样品中的每种组分进行精准质谱分析。GC-MS目前已被广泛用于分析有机化学试剂[32-34]、食品添加剂[35]、药物[29]、代谢物[36-38]等领域中的稳定同位素标记化合物。中华人民共和国化工行业标准HG/T 5170—2017《稳定同位素氘标记试剂卤代苯的同位素丰度测定 气相色谱-质谱联用法》[39]采用基于GC-MS的质量簇法计算氘(D)标记试剂的同位素纯度,这一方法考虑了化合物中非标记位置元素的天然同位素贡献,并将其去除。除了该标准,许多文献也报道了基于此方法的同位素纯度计算[34,40]。
然而,GC-MS无法分析高极性、热不稳定或大分子样品(如蛋白质、糖类、强极性药物),这类样品在气相色谱的高温下会分解或无法气化。此外GC-MS通常采用电子电离(EI),在D标记的同位素纯度分析中,可能会出现碎片离子[M-Di+2-H2]+·/[M-Di+4-D2]+·、[M-Di+1-H]+/[M-Di+2-D]+与M-Di+·的质量峰重叠问题[41]。这些因素限制了GC-MS在复杂极性样品分析中的应用,需在实验设计中考虑液相色谱-质谱(LC-MS)等其他技术。
1.2 液相色谱-质谱(LC-MS)
与GC-MS类似,LC-MS凭借优异的分离能力,在同位素纯度分析领域同样获得了广泛应用[42,43]。其核心优势在于特别适合分析复杂样品中的大分子、极性化合物以及难气化的化合物,如蛋白质等高极性大分子[44,45]。此外,LC-MS无需复杂气化过程,样品经过合适的前处理后,可适配更多类型复杂基质的分析需求;同时,它还具备较高灵敏度,能够精准检测低浓度的标记同位素[41]。
近期,Bi等[43]开发了一种基于LC-MS测定D标记药物SOTYKTU中的同位素异构体杂质的方法,该方法采用低分辨质谱,对仪器分辨率要求较低,更适配QC实验室的常规操作需求。在这类低分辨率LC-MS的应用场景中,同位素纯度计算仍以质量簇法为主,郑波等[46]在专利中详细阐述了如何用质量簇法针对不同样品的同位素纯度进行分析计算。郑波等[47]基于此方法提出了电喷雾质谱(ESI-MS)质量重心法快速表征 15N标记氨基酸同位素丰度。
随着超高效液相色谱(UPLC)的普及,LC-MS的分离能力不断提升,基于此技术的同位素纯度分析方法也应运而生。在此背景下,牟翰等[45]根据物质在超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)中生成的母离子和子离子碳链长短及子离子是否含有 13C等特性,建立了“一对一”法、“一对多”法和选择离子监测法(SIM)等同位素丰度检测方法,并应用这些方法对自然丰度标准品与 13C标记实验样品进行检测,最终根据实验值与理论值的吻合程度筛选出最优分析方法。Zhang等[41]提出在某些情况下D标记信号较弱的问题,可采用基于超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)的总离子流图(TIC)中[M-Di+H]+(0≤i≤n)单同位素峰的提取离子流(EIC)峰面积实现分析。该方法通过将隔离窗口设为窄范围(相对质量误差=5×10-6)来提取目标信号,有效排除相邻等质量离子(Isobaric ions)的干扰,从而精确计算同位素纯度。
由于LC-MS通常采用ESI或大气压化学离子化(APCI)等离子源,这类离子源的设计更适配极性化合物的离子化过程,导致某些低极性化合物(如部分弱极性烃类、非极性酯类)在其中的离子化效率偏低。除离子源适配性问题外,液相色谱的分离特性也会给同位素纯度分析带来挑战:其分离周期通常较长,若目标样品需通过梯度洗脱实现复杂组分分离,不仅会延长单次分析耗时,还会因大量消耗甲醇、乙腈等色谱级有机溶剂直接提高试剂成本;同时,梯度洗脱对色谱柱的洗脱强度波动更大,会加速固定相损耗,长期使用也会增加仪器维护成本。
1.3 直接进样
随着静电场轨道阱质谱仪(Orbitrap)等HRMS技术的飞速发展,仪器分辨率的显著提升使得准确鉴定离子的元素组成成为可能。近年来,基于HRMS的直接进样同位素纯度分析技术应运而生,Zhang等[41]提出了利用超高分辨率Q Exactive HF Orbitrap质谱仪,建立了一种直接进样分析D标记有机化合物同位素纯度的方法。该方法凭借其超高分辨率,能够有效分离相邻的等质量异构体离子,从而确保各同位素异构体离子峰的强度不受邻近离子干扰。基于此,研究者提出了同位素纯度计算公式(1)。
(i=0,1,…,n)
(1)
式中,Ai是相对丰度;i是贡献的同位素标记个数。
Liang等[48]同样采用基于超高分辨率Q Exactive HF Orbitrap质谱仪的直接进样法,对D、13C、15N这3种常用稳定同位素标记化合物的同位素纯度进行了分析。该研究首先利用无限分辨率模拟MS图,揭示了此类分析面临的核心挑战:如何精确分辨由不同标记组合产生的等质量异构体离子。文章强调,超高分辨率是实现有效分离的决定性因素。为解决这一难题,作者创新性地提出使用“代表性同位素异构体离子(Representative isotopolog ions)”来表征每种标记状态占总体的物质的量比,并进一步采用去卷积算法,以消除各代表性离子峰中天然同位素丰度的贡献,见公式(2)。
[r/(100-r)](j-i)}
(2)
式中,f是非标记位置上天然H、N或C原子的数量,0≤h≤j-i,且“h”为正整数;r是目标同位素的天然丰度;j是当前研究的代表性同位素离子;i是校正后的所有前序代表性同位素离子(0≤i≤j-1);Ij(measured)是包含特定代表性同位素离子的质量峰的测量强度;Ij(corrected)是去除所有前序离子物种的天然同位素丰度贡献后,特定代表性同位素离子的校正强度。
将公式(2)所得的校正后代表性同位素离子强度代入公式(3),计算同位素纯度。
Isotopic purity=
(3)
式中,a表示标记位置上同位素原子的最大数量。
为便于计算,作者基于Python语言开发了专用程序,以实现同位素标记化合物的高效数据处理与纯度快速计算。
基于HRMS的直接进样法具备分析快速、样品消耗少及经济性好等诸多优势,在同位素纯度分析领域展现出良好的应用前景。然而,由于该方法缺乏色谱分离步骤,难以应对复杂基质样品,其中的共存杂质会对待测物信号构成直接干扰。因此,该方法的适用范围存在局限,目前主要适用于纯化合物或基质简单的样品。
1.4 同位素比质谱(IRMS)
在植物样品中氮含量与 15N同位素纯度的同步分析领域,元素分析-气体同位素比质谱法(EA-IRMS)展现出显著优势。Xie等[49]相关研究以EA-IRMS为核心技术,通过精准的实验设计与数据处理,构建了高效的同位素纯度分析方法。该方法选用EA Flash IRMS型元素分析仪(Thermo fisher scientific)、Conflo Ⅳ型连续流接口装置与Delta Ⅴ Advantage型稳定同位素比质谱仪组成分析系统,以高氮含量的L-谷氨酸(USGS 40,氮含量9.52%)和低氮含量的杨树叶(GBW 10235,氮含量0.95%)为标准物质,覆盖植物样品常见氮含量范围。实验中,将0.8 mg植物样品封装于锡胶囊后经EA燃烧生成含 15N的氮气,IRMS采集m/z 28(14N14N)和m/z 29(14N15N)的峰高强度,采用加权最小二乘法(WLS)以1/x2为权重建立氮元素质量与m/z 28、29总峰高强度的标准曲线,拟合度R2达0.9996。
此外,研究还评估了质量歧视效应、锡胶囊耗材、同位素记忆效应及氮质量对结果的影响,通过控制氮质量在5～39 μg之间、120 ℃烘烤仪器部件 18 h并更换反应管等措施,有效保障了检测准确性,与传统方法对比,氮含量测定偏差<0.2%,15N同位素丰度偏差<0.2 atom% 15N。
IRMS在同位素分析领域具备显著技术优势,其核心价值在于对同位素比值的高精准检测能力,能为不同研究场景提供可靠的同位素组成数据。同时,通过与EA、GC等前处理或分离设备联用[49-51],IRMS可实现特定元素含量与对应同位素纯度的同步测定,大幅提升分析效率,减少样品消耗量。IRMS能同步测定元素含量与同位素丰度,显著提升效率并降低样品消耗,但也存在一定局限:一是适用性受限,仅能分析可转化为特定气体(如CO2、N2)的样品;二是定性能力不足,无法识别化学结构,分析未知样品必须依赖已知信息;三是定量依赖标样,缺乏标准物质则精度难保,且仅支持单元素靶向分析,无法实现多组分全定量。
2 质谱法在同位素纯度分析中的关键问题与挑战
2.1 同位素异构体
元素组成相同但同位素组成不同的分子和离子被称为同位素异构体(Isotopolog)[52],这一概念在MS法同位素纯度分析中不容忽视。常规MS分析中,常使用“单一同位素质量(Monoisotopic mass)”来指代同位素异构体离子中丰度最高者的质量[41]。鉴于该定义对于D2O等标记化合物(其中氢的最高丰度同位素为H而非D)并不适用,Attygalle等[53]指出应避免在此类情境下使用该术语。有鉴于此,本文提议使用“代表性同位素异构体离子”以更准确地描述相关概念,避免混淆[48]。
2.2 同位素纯度
同位素纯度本质上由两个因素决定:(1)每类代表性同位素异构体离子占总体的物质的量比;(2)该类离子所贡献的标记同位素数目。尽管现有计算公式在形式上有所不同,但其核心思路均基于上述两个因素。例如,郑波等[46]基于“质量簇法”提出的计算公式(4),以及Zhang等[41]基于ESI-HRMS提出的计算公式(1)。比较可知,公式(4)的分子和分母同时除以标记位点数n即可转换为公式(1),表明二者在数学本质上是相同的。
atom%HX=∑(x1abj×j)/(n×∑x1abj)
(j=0,1,…,n)
(4)
式中,atom%HX是稳定同位素标记有机化合物CxHyNwOz(Xn)的 HX同位素丰度。
通常,确定代表性同位素异构体离子所贡献的标记同位素个数相对直接,而难点在于精确计算其真实的物质的量比例。目前,估算物质的量比的主要方法有两种:一是提取各代表性离子的提取离子色谱图峰面积[54],二是直接使用其MS图中的信号强度[41,48]。然而,无论采用哪种方法,都必须考虑并校正非标记位点原子天然同位素丰度的贡献。根据IUPAC数据,13C、15N和D的天然丰度分别为1.07%、0.368%和0.0115%[55]。鉴于D的天然丰度极低,其影响通常可忽略不计;但当化合物中非标记N原子数目较多时,15N的贡献则需纳入考量;而对于 13C,由于其天然丰度相对较高,无论非标记碳原子数量多少,其影响一般不容忽视。
图1展示了同位素纯度为50%的化合物辛酸-1-13C的ESI负离子模式模拟MS图[33,34]。如图所示,该化合物的同位素异构体离子数目众多,这些离子主要源于非标记部分“C7H15O2”的天然同位素分布。为便于分析,可将图中物种分为两类:[C7H15O2(13C012C)]-(图中虚线部分)和[C7H15O2(13C12C0)]-(图中实线部分)。由于每类中包含多个同位素异构体离子,为量化其物质的量比例,选取每类中质荷比最小的离子作为代表性同位素异构体离子。图中m/z 144.1106处的峰由代表性同位素异构体离子[12C7H1516O2(12C013C)]-(该峰的实线部分)和C7H1516O2(12C13C0)的第一 13C同位素峰[12C613CH1516O2(12C13C0)]-(该峰的虚线部分)共同组成,若想得到代表性同位素异构体离子[12C7H1516O2(13C12C0)]-的物质的量比,就要在该峰强度中扣除C7H1516O2(13C012C)的第一 13C同位素峰[12C613CH1516O2(13C012C)]-的贡献。将校正后的代表性同位素异构体离子[12C7H1516O2(13C12C0)]-和[12C7H1516O2(13C012C)]-的MS峰信号强度(或相对丰度)代入公式(1)或(4)中即可得到 13C同位素纯度。
2.3 同位素纯度、同位素丰度和同位素富集
在文献与试剂公司的产品标识中,“同位素纯度(Isotopic purity)”、“同位素丰度(Isotopic abundance)”与“同位素富集(Isotopic enrichment)”这3个术语常被混用。为避免歧义,本文对此作出如下区分。根据IUPAC的定义:同位素富集是指通过特定过程提高某元素中指定同位素丰度的操作;同位素丰度则指某一特定同位素在其元素所有同位素原子总数中所占的原子分数[56]。IUPAC虽未对“同位素纯度”给出明确定义,但综合相关文献,可将其理解为:在特定的标记位点上,目标标记同位素(如 13C)的原子数占该位点总原子数的百分比。
以图1中的辛酸-1-13C为例:在该化合物完全标记的理想情况下,有1个碳原子被标记为 13C。若其C7H16O2(13C012C)与C7H16O2(13C12C0)的物质的量比均为50%,则其同位素纯度为50%。然而,在计算该化合物的同位素丰度时,必须计入非标记位置7个碳原子的天然 13C贡献,所得结果将显著高于50%。由此可见,同位素纯度能更直接地反映特定标记位点的标记效率;同位素丰度则受非标记位点天然同位素丰度的显著影响;而同位素富集明确指向一个过程,易与前两者区分。因此,在对标记化合物进行表征时,推荐使用“同位素纯度”这一术语,以更精准地评估标记效果。
同位素异构体离子计算方法设置为高分辨率,最小丰度设置为1%。勾选了“Show Plot”和“Show Mass Labels”
选项。虚线部分为去质子化的C7H16O2(13C012C)离子物种,实线部分为去质子化的C7H16O2(13C12C0)离子物种,两个离子物种的代表性同位素异构体离子[12C7H1516O2(13C012C)]-和[12C7H1516O2(13C12C0)]-的丰度的物质的量比为1∶1
图1 使用“Isotope Distribution Calculator and Mass Spec Plotter”应用程序(https://www．sisweb．com/mstools/isotope．htm)生成同位素纯度为50%的化合物辛酸-1-13C的ESI负离子模拟质谱图
Fig．1 We utilized the “Isotope Distribution Calculator and Mass Spec Plotter” application (https://www．sisweb．com/mstools/isotope．htm) to generate the ESI negative ion simulated mass spectrum of the compound Caprylic acid-1-13C with an isotopic purity of 50%
3 总结与展望
同位素纯度分析在化学、生物学、医学及环境科学等诸多领域扮演着关键角色,是保障同位素标记化合物研究结果准确性的基石。当前,以GC-MS和LC-MS为代表的色谱质谱联用技术已成为该领域的主流分析手段,其灵敏度和准确性随着技术迭代而不断提升。以Orbitrap为代表的HRMS技术,凭借其卓越的分辨能力,实现了对复杂基质中同位素异构体的精准识别与定量,拓展了分析精度的边界。与之相伴,标准化的分析流程与计算模型也日趋完善,为结果的可比性与可重复性提供了重要支撑。
展望未来,尽管技术已取得长足进步,同位素纯度分析仍面临若干挑战。例如,对多同位素标记化合物以及复杂实际样品的高通量、高精度分析,仍需开发更为强大的方法。HRMS虽性能优异,但其高昂的成本与复杂的数据处理流程在一定程度上制约了其普及。因此,未来的研究应致力于优化现有技术的成本效益与自动化水平,并积极探索新的分析策略。同时,随着绿色技术、精准医学等领域对标记化合物需求的持续增长,推动分析技术的标准化与普及化,使其在更广阔的应用场景中发挥核心作用,将是该领域发展的明确方向。
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