阿尔兹海默症(AD)是一种渐行性神经退行性疾病,是导致痴呆的主要原因[1]。胆碱酯酶的过度表达会导致Aβ聚集,神经纤维缠结(NFT),神经炎症、神经元死亡等AD相关病理变化[2-5]。胆碱酯酶抑制剂卡巴拉汀结构中氨基甲酸酯部分被认为是开发胆碱酯酶抑制剂的有效官能团[6]。
单胺氧化酶(MAO)是导致AD患者的氧化应激和痴呆的行为和心理症状的几种酶之一[7]。MAO抑制剂的一个共同结构特征,称为炔丙胺(Propynilamine)部分,经常被用于赋予多靶点定向配体中单胺氧化酶抑制效力[8]。
灯盏乙素及其活性代谢物灯盏乙素苷元(Scutellarein)具有广泛的药理活性,包括抗氧化、神经保护、金属螯合和抗炎特性,以及改善Aβ诱导的损伤等[9-12],表明灯盏乙素可能成为治疗AD的有利药物。
基于AD这种神经退行性疾病表现出复杂的发病机制,人们的注意力正转向探索多靶点定向配体策略(MTDLs),即单个药物分子可以同时与疾病病理相关的多个靶点结合并调节[13]。
本实验根据多靶点定向配体策略,以灯盏乙素苷元为骨架,通过不同的连接体,连接N,N-双取代氨基甲酸酯片段和炔丙胺、N-甲基炔丙胺片段,设计并合成抗AD灯盏乙素苷元衍生物,并进行活性测试。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
ZF-I型三用紫外分析仪(上海舒源分析仪器厂);Xevo G2-S QTof型高分辨质谱仪(美国 Waters公司);JNM-ECS400型核磁共振波谱仪、JEM-1400FLASH型透射电子显微镜(日本JEOL公司);LC-2040C 3D型高效液相色谱仪(岛津仪器苏州有限公司);Varioskan LUX型多功能酶标仪(美国Thermo公司)。
灯盏乙素(>98%,昆明涞章医药科技有限公司);二氯二苯甲烷(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司);二乙二醇二甲醚、乙酰氯、N-甲基炔丙胺、丁二酸酐、戊二酸酐、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)、5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、酒石酸卡巴拉汀、硫磺素T、甘氨酸-NaOH缓冲液(上海麦克林科技有限公司);N,N-二甲基甲酰氯、N-甲基-N-乙基甲酰氯、N,N-二乙基甲酰氯、碘化钾、氘代DMSO(上海泰坦科技股份有限公司);炔丙胺、氯乙酰氯、叔丁醇钾(上海毕得医药科技股份有限公司);电鳗乙酰胆碱酯酶(eeAChE,美国 Sigma-Aldrich公司);PBS磷酸盐(北京索莱宝科技有限公司);Aβ1-42(上海碧云天生物技术有限公司);姜黄素(上海源叶生物科技有限公司);2%磷钨酸(河南锐欣实验用品有限公司);其他所用试剂均为市售化学纯或分析纯。
1.2 实验步骤
1.2.1 灯盏乙素苷元的制备
图1 灯盏乙素苷元的制备
Fig.1 Preparation of the scutellarein
3 mol/L硫酸-95%乙醇溶液的制备:①先配制95%乙醇:取950 mL的无水乙醇于1 000 mL容量瓶中,用超纯水定容,摇匀,装入备用瓶。②取163 mL(18.4 mol/L)浓硫酸,少量多次加入到盛有上述95%乙醇的大烧杯中,勤搅拌,待冷却后,转移至1 000 mL容量瓶,用95%乙醇定容,摇匀备用。
苷元的制备:取2.00 g灯盏乙素于250 mL的圆底烧瓶中,加入180 mL的上述硫酸-乙醇溶液,80 ℃回流20 h,至橘红色澄清液体。反应结束后,倒入盛有2 L冰水的大烧杯中,待沉淀析出完全后,抽滤,超纯水反复洗涤滤饼至中性,用无水乙醇溶解并减压旋干,得到黄色灯盏乙素苷元粗品,产率70%,直接用于下一步反应。
1.2.2 二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元的合成
图2 二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元的合成
Fig.2 Synthesis of the scutellarein protected by diphenylketone
在250 mL的干燥洁净圆底烧瓶中,加入500 mg(1.75 mmol)灯盏乙素苷元,加入14 mL二乙二醇二甲醚(DEME)将苷元溶解,加入251.6 mg(1.75 mmol)对二甲氨基吡啶(DMAP),常温搅拌下缓慢滴加二氯二苯甲烷,滴毕,将体系升温回流反应2 h。反应结束后,加入适量石油醚,待晶体析出完全后,去上清液,残余物经硅胶柱层析分离纯化,洗脱剂为V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶70,得橘黄色粉末,产率为65%。
1.2.3 灯盏乙素苷元-4′-N,N-双取代氨基甲酸酯的合成(化合物3a～3c)
图3 化合物3a～3c的合成
Fig.3 Synthesis of compounds 3a～3c
在250 mL干燥洁净的圆底烧瓶中,加入 438 mg(1 mmol)二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元,20 mL四氢呋喃、80 mL的乙腈使其溶解。0 ℃下加入165.9 mg(1.2 mmol)碳酸钾,保持低温反应10 min,加入4 mg(0.03 mmol)DMAP,缓慢滴加1.1 mmol的N,N-双取代的氨基甲酸氯,滴毕,保持反应低温反应10 min,取出后,将体系升温至40 ℃,反应10～20 h,TLC检测反应完全后,过滤旋干,硅胶柱层析分离纯化,洗脱剂为V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5,得淡黄色二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元-4′-N,N-双取代氨基甲酸酯。
将30 mL乙酸乙酯加入到干燥洁净的圆底烧瓶中,-5 ℃搅拌下,加入3 mL甲醇,-5 ℃保温反应10 min,加入3 mL乙酰氯,-5 ℃低温反应3 h。分别取上一步制得的3种二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元-4′-N,N-双取代氨基甲酸酯100 mg,加入上述氯化氢饱和的乙酸乙酯溶液中,保持-5 ℃低温反应2 h后升温至室温,搅拌17～20 h。待反应体系中有黄色沉淀物析出且沉淀物不再增加时,将反应液减压蒸干,石油醚多次洗涤,分别制得3种黄色粉末,为4-(5,6,7-三羟基-4-氧代-4H-色烯-2-基)苯基二甲基氨基甲酸酯(化合物3a,产率60.4%)、4-(5,6,7-三羟基-4-氧代-4H-色烯-2-基)苯基甲基(乙基)氨基甲酸酯(化合物3b,产率62.8%)、4-(5,6,7-三羟基-4-氧代-4H-色烯-2-基)苯基二乙基氨基甲酸酯(化合物3c,产率65.7%)。
1.2.4 4-(5,6-二羟基-4-氧代-7-(2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙氧基)-4H-色烯-2-基)苯基二取代氨基甲酸酯(4a～4c)
1.2.4.1 中间体Intermediate A的合成
图4 中间体A的合成
Fig.4 Synthesis of Intermediate A
在干燥的圆底烧瓶中,加入20 mL二氯甲烷,冰浴(0 ℃)下,依次加入980 μL(15 mmol)炔丙胺,800 μL(10 mmol)氯乙酰氯,反应1 h,过滤,除去白色沉淀,用冷的0.5 mol/L盐酸水溶液快速洗涤该溶液,干燥,并真空浓缩以获得白色粉末Intermediate A,产率为89%。
1.2.4.2 4-(5,6-二羟基-4-氧代-7-(2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙氧基)-4H-色烯-2-基)苯基二取代氨基甲酸酯(化合物4a～4c)
图5 化合物4a～4c的合成
Fig.5 Synthesis of compounds 4a～4c
在100 mL干燥圆底烧瓶中,加入4 mL DMF,20 ℃下依次加入500 μmol中间体3a、241.74 mg(2.15 mmol)的t-BuOK,20 ℃保温反应1 h;在另一100 mL干燥圆底烧瓶中,加入1 mL DMF,20 ℃下加入106.29 mg(807.88 μmol)中间体 Intermediate A。上述二者混合后,升温至 60 ℃,反应 12 h。整个过程在N2保护下进行。反应结束后,加入20 mL水,40 mL EA萃取3次,20 mL饱和食盐水洗涤,合并有机层,Na2SO4干燥,减压蒸干溶剂,硅胶柱层析分离纯化,洗脱剂为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1,得淡黄色油状液体4a。化合物4b、4c同化合物4a同法制得,产率52.6%～55.3%。
4-(5,6-二羟基-4-氧代-7-(2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙氧基)-4H-色烯-2-基)苯基二甲基氨基甲酸酯(4a):淡黄色油状液体,总产率为14.46%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:8.11(d,2H,J=8.8 Hz);7.34(d,2H,J=8.9 Hz);7.00(d,2H,J=4.1 Hz);4.04(d,2H,J=8.2 Hz);3.19(t,1H,J=2.6 Hz);3.07(s,3H);2.93(s,3H)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.47,166.50,162.74,154.18,153.45,151.57,149.24,146.33,130.09,127.65,127.53,122.56,105.88,104.49,92.40,80.87,73.33,67.75,36.38,36.20,27.58。ESI-MS,m/z:453.128 9[M+H]+。
4-(5,6-二羟基-4-氧代-7-(2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙氧基)-4H-色烯-2-基)苯基甲基(乙基)氨基甲酸酯(4b):淡黄色油状液体,总产率为15.46%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:13.11(s,1H);11.26(s,1H);8.68(t,1H,J=5.6 Hz);8.11(d,2H,J=8.9 Hz);7.34(d,2H,J=8.8 Hz);7.00(s,1H);6.69(s,1H);4.52(s,2H);3.99(dd,2H,J=5.6,2.6 Hz);3.45(s,3H);3.18(s,1H);3.05(s,2H);1.20(t,3H,J=7.0 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.77,169.89,163.41,157.63,154.69,153.42,152.86,130.81,128.29,123.03,104.96,104.80,95.23,81.00,73.91,71.70,44.08,34.47,34.16,28.43,13.58,12.74。ESI-MS,m/z:467.144 7[M+H]+。
4-(5,6-二羟基-4-氧代-7-(2-氧代-2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙氧基)-4H-色烯-2-基)苯基二乙基氨基甲酸酯(4c):淡黄色油状液体,总产率为16.53%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:13.11(s,1H);11.26(s,1H);8.68(t,1H,J=5.6 Hz);8.10(d,2H,J=8.5 Hz);7.33(d,2H,J=8.6 Hz);6.98(s,1H);6.68(s,1H);4.52(s,2H);3.99(dd,2H,J=5.6,2.5 Hz);3.41(t,2H,J=7.2 Hz);3.32(q,2H,J=7.1 Hz);3.18(t,1H,J=2.5 Hz);1.21(t,3H,J=7.1 Hz);1.13(t,3H,J=7.1 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.27,169.42,162.93,157.14,154.20,152.93,152.73,152.38,130.33,127.80,127.38,122.51,104.47,104.31,94.75,80.52,73.42,71.22,41.84,41.61,27.96,14.20,13.25。ESI-MS,m/z:481.160 9[M+H]+。
1.2.5 2-(4-((二取代氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基4-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-氧代丁酸酯的合成(5a～5c)
1.2.5.1 中间体Indiamate B的合成
图6 中间体B的合成
Fig.6 Synthesis of Intermediate B
在干燥的圆底烧瓶中,加入20 mL二氯甲烷、1.27 mL(15 mmol)N-甲基炔丙胺、1 g(10 mmol)丁二酸酐,冰浴(0 ℃)反应1 h,用冷的0.5 mol/L盐酸水溶液快速洗涤该溶液,干燥,并真空浓缩以获得淡黄色油状液体Intermediate B,产率为84%。
1.2.5.2 2-(4-((二取代氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基4-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-氧代丁酸酯的合成(5a～5c)
图7 化合物5a～5c的合成
Fig.7 Synthesis of compounds 5a～5c
在100 mL干燥圆底烧瓶中,加入5 mL DMF,室温25 ℃下依次加入500 μmol中间体3a(3b、3c),2 mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA),中间体Intermediate B,室温反应12 h。整个过程在N2保护下进行。反应结束后,加入20 mL水,40 mL EA萃取3次,20 mL饱和食盐水洗涤,合并有机层,Na2SO4干燥,减压蒸干溶剂,硅胶柱层析分离纯化,洗脱剂为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1,得淡黄色油状液体,产率为63.2%～65.7%。
2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基4-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-氧代丁酸酯(5a):淡黄色油状液体,总产率为17.37%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:12.99(s,1H);11.19(s,1H);8.11(d,2H,J=8.8 Hz);7.33(d,2H,J=8.9 Hz);6.99(s,1H);6.68(s,1H);4.19(dd,2H,J=25.4,2.5 Hz);3.17(t,1H,J=2.5 Hz);3.06(s,3H);3.04(s,2H);2.93(s,3H);2.87(d,3H,J=3.0 Hz);2.74(dt,2H,J=23.7,6.6 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.63,170.82,163.53,157.13,154.70,154.47,153.89,152.83,128.32,127.87,122.98,122.78,105.11,104.40,94.81,80.14,79.7,75.53,74.55,36.83,36.65,36.17,34.38,33.56,28.80,27.93。ESI-MS,m/z:509.155 6[M+H]+。
(2-(4-((甲基(乙基)氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基4-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-氧代丁酸酯(5b):淡黄色油状液体,总产率为18.77%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:12.99(s,1H);11.17(s,1H);8.12(d,2H,J=8.9 Hz);7.34(d,2H,J=8.9 Hz);7.00(s,1H);6.68(s,1H);3.18(s,1H);3.05(s,3H);3.04(s,3H);2.92(s,2H);2.87(s,2H);2.76(t,2H,J=6.6 Hz);2.70(t,2H,J=6.7 Hz);1.20(t,3H,J=7.1 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.62,170.82,163.54,157.11,154.69,154.47,152.83,128.32,127.87,122.97,122.78,105.11,104.41,94.80,80.14,75.52,74.54,44.06,36.17,34.38,33.56,28.79,27.93,13.54,12.70。ESI-MS,m/z:523.170 9[M+H]+。
2-(4-((二乙基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基4-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-4-氧代丁酸酯(5c):淡黄色油状液体,总产率为19.37%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:12.99(s,1H);11.16(s,1H);8.12(d,2H,J=8.9 Hz);7.34(d,2H,J=8.9 Hz);7.00(s,1H);6.68(s,1H);4.23(d,1H,J=2.6 Hz);4.16(d,1H,J=2.5 Hz);3.43(d,2H,J=7.1 Hz);3.18(t,1H,J=2.5 Hz);3.04(s,2H);2.87(s,3H);2.73(dt,3H,J=22.5,6.5 Hz);1.22(t,4H,J=6.6 Hz);1.14(t,3H,J=6.3 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.63,170.82,163.55,157.11,154.68,154.47,153.19,152.83,128.33,127.83,122.95,122.77,105.11,104.41,94.80,80.14,79.73,75.53,74.55,42.07,36.17,34.38,33.55,28.79,27.92,14.66,13.70。ESI-MS,m/z:537.186 5[M+H]+。
1.2.6 2-(4-((二取代氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯的合成(6a～6c)
1.2.6.1 中间体Indiamate C的合成
图8 中间体C的合成
Fig.8 Synthesis of Intermediate C
中间体Intermediate C与Intermediate B同法,得淡黄色油状液体,产率为87%。
1.2.6.2 2-(4-((二取代氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯的合成(6a～6c)
图9 化合物6a～6c的合成
Fig.9 Synthesis of compounds 6a～6c
合成化合物6a～6c与合成化合物5a～5c同法,得淡黄色油状液体,产率59.7%～64.8%。
2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6a):淡黄色油状液体,总产率为17.81%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:13.01(s,1H);11.30(s,1H);8.12(d,2H,J=8.8 Hz);7.34(d,2H,J=8.9 Hz);7.00(s,1H);6.68(s,1H);4.17(dd,2H,J=12.9,2.5 Hz);3.16(m,2H);3.07(s,3H);3.01(s,2H);2.94(s,3H);2.86(m,2H);2.66(t,2H,J=7.4 Hz);1.88(q,2H,J=7.3,6.8 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.63,171.79,171.10,163.55,157.11,154.71,154.47,153.89,152.74,128.32,127.87,122.98,122.76,105.10,104.41,94.83,80.29,75.42,74.40,36.83,36.65,35.97,34.45,33.24,32.86,31.57,20.64。ESI-MS,m/z:523.171 0[M+H]+。
(2-(4-((甲基(乙基)氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6b):淡黄色油状液体,总产率为17.06%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:13.01(s,1H);11.32(s,1H);8.12(d,2H,J=8.8 Hz);7.34(d,2H,J=8.8 Hz);7.00(s,1H);6.69(s,1H);4.17(dd,2H,J=12.8,2.5 Hz);3.44(q,2H,J=7.7,7.2 Hz);3.05(s,3H);3.01(s,3H);2.89(s,1H);2.69～2.63(m,2H);1.88(dd,2H,J=14.3,7.0 Hz);1.20(t,2H,J=7.0 Hz);1.12(t,3H,J=7.2 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.17,171.33,170.63,163.09,156.63,154.23,154.00,152.28,127.86,127.39,122.51,122.29,104.64,103.96,94.37,79.83,79.36,74.96,73.94,43.59,35.51,33.98,33.66,32.78,32.40,31.11,20.17,13.08,12.24。ESI-MS,m/z:537.186 3[M+H]+。
2-(4-((二乙基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6c):淡黄色油状液体,总产率为18.74%。1HNMR(DMSO-d6,400 MHz),δ:13.00(s,1H);11.32(s,1H);8.12(d,2H,J=8.9 Hz);7.34(d,2H,J=8.9 Hz);7.00(s,1H);6.74(s,1H);4.18(m,3H);3.44(q,4H,J=7.7,7.2 Hz)3.32(s,1H);3.01(s,2H);2.87(s,2H);2.67(t,2H,J=7.4 Hz);1.89(q,2H,J=7.4 Hz);1.22(t,3H,J=5.7 Hz);1.14(t,3H,J=6.9 Hz)。13CNMR(DMSO-d6,101 MHz),δ:182.61,171.80,163.85,163.52,157.39,154.67,154.49,153.19,152.70,128.32,127.84,122.96,122.80,105.08,104.30,94.87,80.29,75.42,74.41,42.31,42.08,35.97,34.45,32.86,31.57,20.65,14.65,13.70。ESI-MS,m/z:551.202 4[M+H]+。
1.3 胆碱酯酶活性测试以及酶动力学测试
采用Ellman法[14]对目标化合物进行胆碱酯酶活性测试。实验试剂的配制:(1)PBS缓冲液的配制:将一包一定规格的PBS缓冲盐溶于规定体积超纯水中,得到0.01 mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液。(2)酶的稀释:将500 U的乙酰胆碱酯酶溶解于50 mL的PBS缓冲液中,使其浓度为10 U/mL,分装冻存于-80 ℃冰箱,临用时以PBS稀释至所需浓度。(3)底物的配制:精密称取21.688 5 mg ACTI于10 mL容量瓶中,用PBS磷酸盐缓冲溶液充分溶解并定容,配成7.5 mmol/L的ATCI溶液(现配现用,溶解后尽快使用)。(4)显色剂的配制:精密称取39.635 0 mg的DNTB于10 mL容量瓶中,用PBS磷酸盐缓冲溶液溶解,滴加饱和NaHCO3至溶液变为澄清黄色液体后,用PBS定容,得到10.0 mmol/L的DTNB溶液(现配现用,溶解后尽快使用)。(5)待测样品与阳性对照药的配制与稀释:精密称取待测样品和阳性对照药酒石酸卡巴拉汀,用DMSO溶解为5 mmol/L的母液,临用时用磷酸盐缓冲液分别稀释至不同浓度梯度。
96孔板中依次加入140 μL PBS、20 μL酶、20 μL待测物或对照品(测试组),同时设置测试本底组(20 μL PBS代替酶溶液)、空白组(20 μL PBS代替待测化合物或对照品)、空白本底组(180 μL PBS)。37 ℃培养20 min后,依此加入现配的10 μL DTNB和10 μL的ATCI,每孔溶液总体积为200 μL。37 ℃培养10 min后,然后立刻使用酶标仪测试化合物在412 nm处的OD值。每组数据重复做3次,取平均值。根据公式(1)计算抑制率,用GraphPad Prism 8.0计算出化合物抑制胆碱酯酶的IC50。
抑制率(%)=[1-(OD测试组-OD本底组)/
(OD空白组-OD空白本底组)]×100%
(1)
配制不同浓度的ATCI底物(15、12、9、6、3 mmol/L),不同浓度的化合物(0、0.5 IC50、IC50、2 IC50)。96孔板中依次加入140 μL PBS缓冲液、20 μL PBS(空白组)或20 μL不同浓度的化合物(测试组)、20 μL乙酰胆碱酯酶。同时设置空白本底组和实验本底组(以PBS代替胆碱酯酶)。加毕,混匀后37 ℃孵育20 min,立即加入10 μL DTNB溶液及10 μL不同浓度的ATCI,37 ℃孵育10 min后立刻在波长412 nm处检测OD值。每个实验独立重复3次,通过Origin分析计算出不同底物浓度下的酶促反应速度,绘制速度与底物的双倒数图,并通过图形来判断抑制类型。根据双倒数图,做该图形的样品浓度与曲线斜率图,所得图形X轴的负轴上的截距即为Ki值。
1.4 单胺氧化酶活性测试
采用Holt法[15]对目标化合物进行单胺氧化酶活性测试。实验试剂的配制:(1)磷酸盐缓冲溶液:同AChE。(2)酶的分装:将规格为275 U/mL的单胺氧化酶B在37 ℃下迅速解冻,用磷酸盐缓冲液溶解为10 U/mL,分装后-80 ℃备用。(3)15 mmol/L的苄胺底物:精密称量21.543 mg苄胺至10 mL容量瓶中,用磷酸盐缓冲液溶解并定容。(4)10 mmol/L的香草酸溶液:称取16.815 mg香草酸至10 mL容量瓶中,用磷酸盐缓冲液溶解并定容。(5)10 mmol/L的4-氨基安替吡啉溶液:称取20.324 mg 4-氨基安替吡啉至10 mL容量瓶中,用磷酸盐缓冲液溶解并定容。(6)20 U/mL的辣根过氧化物酶:1 KU辣根过氧化物酶用磷酸盐缓冲液分装成20 U/mL,于-20 ℃冻存。(7)显色剂和底物的配制:取2 500 μL(15 mmol/L)苄胺溶液、1 250 μL(10 mmol/L)香草酸溶液、625 μL(10 mmol/L)4-氨基安替吡啉溶液、500 μL(20 U/mL)辣根过氧化物(HRP)以及125 μL磷酸盐缓冲液混合均匀,现用现配。(8)阳性对照品雷沙吉兰和化合物母液:精密称取后,配制成2.5 mmol/L的母液,临用时,稀释至所需浓度。
在96孔板中加入50 μL单胺氧化酶和 25 μL待测样品溶液或阳性对照溶液,混合均匀后,在37 ℃孵育20 min;孵育完毕,加入50 μL新鲜配制的底物-显色剂混合液,继续在37 ℃孵育 2 h,立刻在酶标仪490 nm波长下测定吸光度值。同时设置测试本底组(50 μL磷酸盐缓冲溶液+25 μL不同浓度待测物或对照品+50 μL底物-显色剂)、空白组(25 μL磷酸盐缓冲溶液+50 μL酶+50 μL底物-显色剂)、空白本底组(75 μL磷酸盐缓冲溶液+50 μL底物-显色剂)。每组数据重复做3次,取平均值。用GraphPad Prism 8.0计算出化合物抑制单胺氧化酶B的IC50(抑制率公式同式(1))。
1.5 化合物抑制/解聚Aβ1-42聚集活性实验
采用硫磺素T法[16]对目标化合物进行抑制/解聚Aβ1-42聚集活性实验。实验试剂的配制:(1)Aβ1-42溶液:在1 mg原装规格的样品管中,加入110.7 μL的DMSO,得2 mmol/L的母液,分装冻存于-80 ℃冰箱,临用时用PBS稀释至所需浓度。(2)硫磺素T溶液:称取31.886 mg的硫磺素T,加入10 mL的容量瓶中,用甘氨酸-NaOH缓冲液定容,得10 mmol/L母液,注意避光保存。临用时以甘氨酸-NaOH缓冲液稀释至所需浓度。(3)阳性对照物姜黄素(Curcumin)溶液:称取36.838 mg的姜黄素,加入10 mL的容量瓶中,用DMSO定容,得10 mmol/L母液,注意避光保存。临用时以PBS缓冲液稀释至所需浓度。(4)化合物溶液:化合物以DMSO溶液为10 mmol/L母液,临用时以PBS缓冲液稀释至所需浓度。以下4个实验中,化合物、Cu2+、Aβ1-42的终浓度均为25 μmol/L,每组实验均独立重复3次。
1.5.1 硫磺素T法检测化合物抑制Aβ1-42自诱导实验
黑色96孔板中加入20 μL Aβ1-42溶液+20 μL PBS(对照组IFc);20 μL PBS溶液+20 μL PBS(对照本底组IFd);20 μL化合物溶液+20 μL Aβ1-42溶液(化合物组IFa);20 μL化合物溶液+20 μL PBS(化合物本底组IFb)。加毕,在37 ℃恒温摇床中孵育24 h,孵育结束后,加入160 μL(5 μmol/L)的硫磺素T溶液,避光振荡1 min,立刻在酶标仪中以激发波长450 nm、发射波长485 nm处测荧光值。通过公式(2)计算化合物抑制Aβ1-42自身聚集的抑制率。
抑制率(%)=[1-(IFa-IFb)/(IFc-IFd)]×100%
(2)
1.5.2 硫磺素T法检测化合物解聚Aβ1-42自诱导实验
黑色96孔板中加入20 μL Aβ1-42溶液,在 37 ℃恒温摇床中孵育24 h,然后分别加入20 μL PBS(对照组IFc);20 μL PBS溶液+20 μL PBS(对照本底组IFd);20 μL化合物溶液(化合物组IFa);20 μL化合物溶液+20 μL PBS(化合物本底组IFb)。加毕,在37 ℃恒温摇床中继续孵育 24 h,孵育结束后,加入160 μL(5 μmol/L)的硫磺素T溶液,避光振荡5 min,立刻在酶标仪中以激发波长450 nm、发射波长485 nm处测荧光值,通过公式(3)计算化合物解聚Aβ1-42自身聚集的解聚率。
解聚率(%)=[1-(IFa-IFb)/(IFc-IFd)]×100%
(3)
1.5.3 硫磺素T法检测化合物抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集实验
黑色96孔板中加入20 μL HEPES缓冲液+20 μL Aβ1-42溶液+20 μL Cu2+(对照组IFc);20 μL HEPES缓冲液+20 μL HEPES缓冲液+20 μL Cu2+(对照本底组IFd);20 μL化合物溶液+20 μL Aβ1-42溶液+20 μL Cu2+(化合物组IFa);20 μL化合物溶液+20 μL HEPES缓冲液+20 μL Cu2+(化合物本底组IFb)。加毕,在37 ℃恒温摇床中孵育24 h,孵育结束后,加入140 μL(5 μmol/L)的硫磺素T溶液,避光振荡1 min,立刻在酶标仪中以激发波长450 nm、发射波长 485 nm处测荧光值,计算化合物抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集的抑制率(公式同式(2))。
1.5.4 硫磺素T法检测化合物解聚Cu2+诱导的Aβ1-42聚集实验
黑色96孔板中加入20 μL Aβ1-42溶液+20 μL Cu2+(对照组IFc);20 μL HEPES缓冲液+20 μL Cu2+(对照本底组IFd);20 μL Aβ1-42溶液+20 μL Cu2+(化合物组IFa);20 μL HEPES缓冲液+20 μL Cu2+(化合物本底组IFb)。加毕,在 37 ℃恒温摇床中孵育24 h,孵育结束后,对照本底组和对照组加入20 μL HEPES缓冲液,化合物组和化合物本底组加入20 μL的化合物,混匀后继续孵育24 h,孵育完毕,加入140 μL(5 μmol/L)的硫磺素T溶液,避光振荡1 min,立刻在酶标仪中以激发波长450 nm、发射波长485 nm处测荧光值,计算化合物解聚Cu2+诱导的Aβ1-42聚集的解聚率(公式同式(3))。
1.6 透射电镜(TEM)观察Cu2+诱导的Aβ1-42聚集/解聚
在抑制Cu2+诱导Aβ1-42聚集的实验中,将Aβ1-42+Cu2+(对照组)、Aβ1-42+Cu2++Curcumin(阳性药组)、Aβ1-42+Cu2++化合物6a(化合物组)同时反应24 h。在解聚Cu2+诱导的Aβ1-42聚集的实验中,将3组Aβ1-42+Cu2+先反应24 h后,再在其中2组加入Curcumin(阳性药组)、化合物6a(化合物组),3组实验再孵育24 h。整个实验过程中Cu2+、Aβ1-42和受试化合物6a的最终浓度分别为25 μmol/L。将每个样品取50 μL置于碳涂层的铜载网上,在室温下静置2 min。每个网格均用2%磷钨酸染色 2 min。滤纸吸取多余的染色溶液,在透射电子显微镜(TEM)下观察聚集的成像情况。
2 结果与讨论
2.1 酶活性测试结果
如表1所示,所有的目标化合物对eeAChE均显示了不同程度的抑制活性,IC50值范围为3.50～12.69 μmol/L,均优于阳性药,这表明N,N-双取代氨基甲酸酯的引入是抑制胆碱酯酶活性的关键。其中化合物4b、4c、6a抑制作用较好,有待进一步的研究。
表1 化合物的eeAChE和MAO-B抑制活性注
Tab.1 eeAChE and MAO-B inhibitory activities of compound
CompoundeeAChEIC50±SD/(μmol·L-1)MAO-BIC50±SD/(μmol·L-1)4a12.69±1.08>1004b3.50±0.77>1004c4.36±0.57>1005a7.45±0.6732.41±0.035b7.30±0.4029.77±0.485c5.89±0.3929.80±0.646a5.06±1.5923.61±0.276b11.75±1.1225.55±1.016c8.95±0.5936.84±0.47Rivastigmine16.17±0.35n.t.Rasagilinen.t.0.16±0.23Scutellarin>200n.t.Scutellarein>200n.t.
注:n.t.=not tested。
从表1可以得出,所有目标化合物对MAO-B均显示了不同程度的抑制活性,除化合物4a、4b、4c外,其余6个化合物的IC50值范围为23.61～36.84 μmol/L,均高于阳性药,这表明化合物的空间位阻可能是阻碍化合物与酶结合的重要因素;而化合物4a、4b、4c表现出较差的抑制活性,这表明炔丙胺基团的N原子上有无取代基对化合物与酶结合的影响较大。其中,化合物6a表现出最好的MAO-B抑制活性,且对eeAChE的抑制活性也较好,因此作为继续深入研究的双靶点化合物。
2.2 酶动力学实验结果
基于上述结果,选择化合物6a进行eeAChE动力学研究,结果如图10a所示,eeAChE的 Lineweaver-Burker图中所有的直线在第三象限中相交于一点,随着化合物(抑制剂)浓度的增加,斜率和截距都增加(即Vmax减少,Km增加),这一结果表明,化合物对eeAChE抑制机理为混合型抑制。以Lineweaver-Burker图中斜率对化合物浓度作图,如图10b所示,得抑制常数Ki值为3.61,表明化合物的抑制能力较强。
图10 a.化合物6a水解eeAChE的Lineweaver-Burk图;b.化合物6a浓度与斜率的关系图
Fig.10 a.Lineweaver-Burk plot of compound 6a for eeAChE hydrolysis;b.Slope replot vs.compound 6a concentration
2.3 抑制/解聚Aβ聚集活性实验结果
如表2所示,所有化合物均有抑制Aβ1-42聚集的作用。除化合物4a、4b、4c外,其余6个化合物抑制Aβ1-42聚集的作用远高于灯盏乙素和姜黄素。选择化合物5a、5b、6a、6b进一步考察其抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集,以及解聚自诱导和Cu2+诱导的聚集,结果如表2。化合物6a抑制自身诱导和Cu2+诱导的抑制率为87.57%和75.01%;化合物6a解聚自身诱导和Cu2+诱导的解聚率为82.22%和77.40%,均优于灯盏乙素和姜黄素。
表2 化合物与阳性药抑制自诱导和Cu2+诱导的Aβ1-42聚集,以及解聚自诱导和Cu2+诱导的Aβ1-42聚集注
Tab.2 Inhibition of self-and Cu2+-induced Aβ1-42 aggregation,and disaggregation of self-and Cu2+-induced aggregates by target and reference compounds
CompoundInhibition% of Aβ1-42 AggregationDisaggregation% of Aβ1-42 AggregationSelf-inducedCu2+-inducedSelf-inducedCu2+-induced4a16.89%±0.02n.t.n.t.n.t.4b26.11%±0.04n.t.n.t.n.t.4c32.18%±0.07n.t.n.t.n.t.5a82.88%±0.0778.33%±0.0186.28%±0.0179.26%±0.025b86.58%±0.0682.29%±0.0290.64%±0.0181.79%±0.015c78.57%±0.09n.t.n.t.n.t.6a87.57%±0.0282.22%±0.0275.01%±0.0477.40%±0.016b86.88%±0.0286.14%±0.0188.85%±0.0171.25%±0.016c73.67%±0.04n.t.n.t.n.t.Scutellarin64.02%±0.0543.94%±0.0156.13%±0.0242.35%±0.03Curcumin51.35%±0.0548.04%±0.0160.96%±0.0758.91%±0.01
注:n.t.=not tested。
2.4 透射电镜(TEM)观察Cu2+诱导的Aβ1-42聚集/解聚
结果见图11,未孵育过的Aβ1-42在电镜下呈比较规整分散的圆形颗粒,Aβ1-42与Cu2+单独孵育24 h后聚集成不规则的纤维状,Aβ1-42与Cu2+单独孵育48 h后聚集成不规则的纤维状较24 h更明显。加入姜黄素和化合物6a后,聚集减少,且与化合物6a孵育的Aβ1-42聚集程度比与姜黄素孵育的Aβ1-42聚集程度明显减少。表明化合物能够有效抑制/解聚Cu2+诱导聚集,且抑制/解聚Cu2+诱导聚集的效果比姜黄素要好。透射电镜结果与硫磺素T法测得的结果一致。
图11 a.化合物6a抑制Cu2+诱导的Aβ1-42聚集透射电镜图;b.化合物6a解聚Cu2+诱导的Aβ1-42聚集透射电镜图
Fig.11 a.TEM images of the Cu2+-induced Aβ1-42 aggregation inhibited by compound 6a;b.TEM images of depolymerization of the Cu2+-induced Aβ1-42 aggregation by compound 6a
3 结论
根据多靶点导向配体策略(MTDLs),设计并合成9个双靶点抗阿尔兹海默症灯盏乙素苷元衍生物。结构通过 1HNMR、13CNMR、ESI-MS进行确证,9个终产物(化合物4a～4c、化合物5a～5c、化合物6a～6c)总产率范围在14.46%～19.37%之间。基于AD的胆碱酯酶假说和单胺氧化酶假说,根据Ellama法和Holt法,进行酶活性测试。结果表明,2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6a)对两种酶表现出较好的抑制活性,对eeAChE的IC50为(5.06±1.59)μmol/L,对MAO-B的IC50为(23.61±0.27)μmol/L。化合物6a与eeAChE的酶动力学表明化合物6a对eeAChE是混合型抑制。
化合物6a不仅对自身和Cu2+诱导的Aβ1-42聚集具有良好的抑制作用(87.57%和82.22%),而且还能诱导自身和Cu2+诱导的Aβ1-42原纤维的分解(75.01%和77.40%)。透射电镜实验证明了这一现象。实验表明,化合物6a可能是一个具有潜力的抗AD化合物,有待在抗氧化活性、金属离子配位、肝微粒体代谢等抗AD活性实验中进一步研究。
[1]BREIJYEH Z,KARAMAN R.Comprehensive review on Alzheimer′s disease:Causes and treatment[J].Molecules,2020,25(24):5 789.
[2]BOHNEN N I,GROTHE M J,RAY N J,et al.Recent advances in cholinergic imaging and cognitive decline-Revisiting the cholinergic hypothesis of dementia[J].Curr.Geriatr.Rep.,2018,7(1):1-11.
[3]IIZUKA T,KAMEYAMA M.Cholinergic enhancement increases regional cerebral blood flow to the posterior cingulate cortex in mild Alzheimer′s disease[J].Geriatr.Gerontol.Int.,2017,17(6):951-958.
[4]SONDAG C M,DHAWAN G,COMBS C K.Beta amyloid oligomers and fibrils stimulate differential activation of primary microglia[J].J.Neuroinflammation,2009,6:1.
[5]黄静玲,梁锦萍,周凤姬,等.具有生物活性的脱氢枞胺衍生物研究进展[J].化学试剂,2022,44(11):1 585-1 597.
[6]MATOSEVIC A,BOSAK A.Carbamate group as structural motif in drugs:A review of carbamate derivatives used as therapeutic agents[J].Arh.Hig.Rada.Toksikol.,2020,71(4):285-299.
[7]YOUDIM M B,EDMONDSON D,TIPTON K F.The therapeutic potential of monoamine oxidase inhibitors[J].Nat.Rev.Neurosci.,2006,7(4):295-309.
[8]ZINDO F T,JOUBERT J,MALAN S F.Propargylamine as functional moiety in the design of multifunctional drugs for neurodegenerative disorders:MAO inhibition and beyond[J].Future Med.Chem.,2015,7(5):609-629.
[9]GUO L L,GUAN Z Z,HUANG Y,et al.The neurotoxicity of beta-amyloid peptide toward rat brain is associated with enhanced oxidative stress,inflammation and apoptosis,all of which can be attenuated by scutellarin[J].Exp.Toxicol Pathol.,2013,65(5):579-584.
[10]GHOSH N,GHOSH R,BHAT Z A,et al.Advances in herbal medicine for treatment of ischemic brain injury[J].Nat.Prod.Commun.,2014,9(7):1 045-1 055.
[11]董永喜.灯盏乙素1,4-二氢喹啉脑靶向性衍生物的设计、合成及活性研究以及灯盏乙素苷元与川芎嗪活性代谢物孪药的设计、合成以及活性研究[D].苏州:苏州大学,2018.
[12]HONG H,LIU G Q.Protection against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity in PC12 cells by scutellarin[J].Life Sci.,2004,74(24):2 959-2 973.
[13]ALBERTINI C,SALENO A,BOLOGNESI M L,et al.From combinations to multitarget-directed ligands:A continuum in Alzheimer′s disease polypharmacology[J].Med.Res.Rev.,2021,41(5):2 606-2 633.
[14]ELLMAN G L,COURTNEY K D,FEATHER-STONE R M,et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[J].Biochem.Pharmacol.,1961,7(2):88-90.
[15]HOLT A,SHARAMAN D F,BAKER G B,et al.A Continuous spectrophotometric assay for monoamine oxidase and related enzymes in tissue homogenates[J].Anal.Biochem.,1997,244(2):384-392.
[16]SANG Z,QIANG X,LI Y,et al.Design,synthesis and evaluation of scutellarein-O-alkylamines as multifunctional agents for the treatment of Alzheimer′s disease[J].Eur.J.Med.Chem.,2015,94:348-366.