响应面法优化高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法分析环境地表水中的形态砷

砷作为一种广泛分布于自然环境的类金属元素,其污染问题已成为全球性环境健康挑战。自然活动如火山喷发、岩石风化等会导致砷的释放,而采矿、冶金、化工生产、农药使用以及含砷废水的排放等人类活动,使得大量砷进入环境,对土壤、水体和大气造成污染[1,2]。地表水作为人类生活和生产的重要水源,近年来,工业废水排放、农业化肥使用及地质活动导致地表水中砷污染加剧[3]。据世界卫生组织(WHO)统计,全球超过1.4亿人面临饮用水砷超标风险[4]。相关研究表明,砷在环境中以多种形态存在,包括无机砷和有机砷两大类。无机砷的存在形式包括亚砷酸根(As(Ⅲ))和砷酸根(As(Ⅴ));而有机砷的存在形式则包括一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)[5-8]。以亚砷酸根(As(Ⅲ))为代表的无机砷具有较高的毒性,相比于As(Ⅴ)和有机形态砷,As(Ⅲ)更容易通过细胞膜进入细胞内部,与细胞内的巯基结合,造成细胞的正常代谢过程紊乱,导致细胞死亡[9]。有机砷尽管毒性较低,但它们可以在一定条件下转化为无机砷,增加毒性风险[10]。因此,仅测定总砷浓度无法准确评估生态与健康风险,准确测定地表水中不同形态砷的组成比例,对于评估砷的环境风险、制定有效的水质污染防治措施具有重要意义。

为了实现环境地表水中形态砷的准确分析,科学家们不断探索和开发新的分析方法。液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术(Liquid Chromatograph Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry,LC-ICP-MS)作为一种高效、灵敏的元素形态分析方法,同时结合了液相色谱(LC)的形态分离能力与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的高灵敏度、多元素检测优势,逐渐成为元素形态分析的主流方法[11-13],已在饮用水、食品的形态砷检测中得到应用[14-16]。尽管LC-ICP-MS在元素形态分析中取得进展,但地表水基质复杂,样品中腐殖酸、金属离子、悬浮颗粒吸附等易引发色谱峰重叠或信号抑制,对样品前处理、色谱分离条件的改进,LC-ICP-MS检测参数优化等方面仍需进一步研究。响应面法(Response Surface Methodology,RSM)作为一种基于统计学的多变量优化方法,通过数学模型解析参数间交互作用,高效确定最优实验条件,已在食品、医药等领域方法开发中展现出显著优势[17,18]。但在环境分析尤其是环境样品形态砷分析中的应用仍未见报道。

本文基于RSM优化高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用(HPLC-ICP-MS)技术,建立了环境地表水中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB、AsC的分析方法。通过选择合适的色谱柱,优化液相色谱的分离条件,实现水中6种形态砷的有效分离;优化电感耦合等离子体质谱的检测参数,提高形态砷的检测灵敏度和准确性;利用标准溶液对建立的HPLC-ICP-MS分析方法进行验证,评估其线性关系、检出限、重复性和加标回收率等指标,并将该方法应用于实际环境地表水样的形态砷分析,探讨不同采样点形态砷含量的差异及其可能的影响因素。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪、Agilent 7700x型电感耦合等离子体质谱仪(美国安捷伦科技公司);Milli-Q Reference型超纯水系统(德国默克公司)。

形态砷混标溶液(GBW(E)082204)、形态砷单标溶液(GBW 08666～GBW 08671)(中国计量科学院);磷酸氢二铵((NH4)2HPO4,分析纯)、乙二胺四乙酸(EDTA,优级纯)(国药集团化学试剂有限公司);硝酸(HNO3,分析纯,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司);氨水(NH3·H2O,优级纯,广州市浩盈化工科技有限公司);硝酸铵(NH4NO3,色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);甲醇(CH3OH,色谱纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集与保存

环境地表水样品采集自河南省洛阳市的洛河、伊河及其周边支流。在洛河和伊河上的多个代表性位置设置了采样点,具体采样点位置如图1所示。采样时,使用经过彻底清洗的500 mL棕色玻璃瓶,于水面下约0.5 m处进行采样。瓶内预先加入适量的EDTA作为保护剂,防止形态砷在采样和保存过程中的变化。采样完成后,立即密封瓶盖,并详细记录采样时间、地点、环境条件等关键信息。随后,将样品迅速运送至实验室,并在 4 ℃的冷藏条件下保存。

1.2.2 样品前处理方法

将采集水样使用0.22 μm聚醚砜滤膜进行过滤,去除水中的悬浮物、泥沙及其他不溶性杂质。将过滤后的样品溶液转移至干净的试样瓶中,进行高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)分析。

1.2.3 标准曲线配制

分别准确称取0.660 5 g亚砷酸根溶液标准物质(GBW08666)、2.857 1 g砷酸根溶液标准物质(GBW08667)、1.992 g一甲基砷溶液标准物质(GBW08668)、0.945 2 g二甲基砷溶液标准物质(GBW08669)、1.288 6 g砷甜菜碱溶液标准物质(GBW08670)和1.785 7 g砷胆碱溶液标准物质(GBW08671)。置于50 mL的容量瓶内,用去离子水定容至刻度,配制成1.0 μg/mL的6种形态砷混合标准溶液。再采用逐级分取稀释的方法配制浓度为0、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的6种形态砷混合系列标准曲线。

1.3 响应面法优化实验设计

设计流动相A的pH(A)、流动相B的甲醇含量(B)、样品进样量(C)进行显著性筛选。每个参数设置3个水平(表1),通过一系列实验考察其对6种形态砷分离效果(以峰面积、分离度及保留时间重复性为指标)的影响。每组实验重复3次,采用Design-Expert 12.0软件进行方差分析(ANOVA),以P值<0.05判定参数显著性。

1.4 色谱与质谱条件

1.4.1 色谱柱与流动相的选择

HPLC-ICP-MS技术应用于环境地表水中形态砷的分析时,色谱柱与流动相的选择是确保分析性能的关键步骤。在本研究中,选用了Hamilton PRP-X100色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)。采用梯度洗脱的方法,流动相A采用6 mmol/L的硝酸铵和6 mmol/L的磷酸氢二铵混合溶液,流动相B采用甲醇水溶液。

1.4.2 梯度洗脱程序

具体洗脱程序如下:初始时,流动相A占0%,流动相B占100%,以1.0 mL/min的流速进行洗脱。在最初的150 s内,维持此流动相比例,以充分洗脱强极性的三价砷(As(Ⅲ))。随后,从150 s至200 s,流动相A的比例逐渐提升至100%,流动相B的比例降低至0,并保持流动相A占100%的比例至630 s,以确保所有对中等极性和弱极性形态砷的充分分离。在630 s至720 s,流动相B的比例逐渐恢复至100%,为下一次进样做准备。

1.4.3 ICP-MS工作参数的设定

本研究中,对ICP-MS的工作参数进行了精细调整和设定,具体工作参数如表2所示。

1.5 干扰消除与校正方法

1.5.1 干扰因素的分析

地表水中的形态砷分析,常见的干扰因素包括多原子离子干扰、同质异位素干扰以及基体效应等。在ICP-MS检测过程中,75As+可能会受到 40Ar35Cl+等多原子离子的干扰,当样品中含有氯离子时,这种干扰现象尤为显著[19]。52Cr+等同质异位素也可能对砷的检测产生干扰。

针对这些干扰因素,本研究采用了多种方法进行消除。一方面,通过优化色谱分离条件,尽量实现目标形态砷与潜在干扰物的基线分离;另一方面,利用ICP-MS的碰撞反应模式,引入碰撞气(He或O2),使干扰离子在碰撞池中发生反应,改变其质荷比,以达到消除干扰的目的。Stetson等[20]的研究中,引入氧气作为碰撞反应气,75As+与氧气反应生成 91AsO+,有效消除了 40Ar35Cl+的干扰。

1.5.2 干扰校正方法的建立

采用碰撞反应池法,选用氦气(He)作为碰撞气。在射频功率为1 550 W时,调节碰撞气流速为4.5 mL/min,以最大化干扰离子(40Ar35Cl+)与目标砷离子(75As+)的分离效果。基于大量实验数据得到了针对 75As+离子的干扰校正方程如公式(1)所示。

式中,Icorrected为校正后的信号强度,cps;Imeasured为实际测得的信号强度,cps;Iinterference为干扰离子的信号强度,cps;0.13为通过大量反复实验确定的校正因子。

2 结果与讨论

2.1 响应面试验及结果分析

采用Box-Behnken设计响应面法实验对流动相A的pH(A)、流动相B的甲醇含量(B)及样品进样量(C) 3因素进行系统优化,共设计17组实验(含5组中心点重复)。以6种形态砷的总分离度(R)为响应值,分析各参数对分离效果的影响规律,实验条件及结果如表3所示。

通过Design-Expert 12.0软件进行二次多项式回归分析,建立了总分离度(R)与流动相A的pH(A)、流动相B的甲醇含量(B)及进样量(C)的二次多项式拟合回归数学方程为:R=10.98+0.58A+0.34B-0.21C-0.45AB-0.32AC-0.28BC-1.16A2-0.99B2-0.65C2,模型方差分析(ANOVA)结果如表4所示。回归模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P=0.213),表明模型误差可控,能够准确预测总分离度的变化规律。调整决定系数

与预测决定系数

接近。

回归方程表明,流动相A的pH(A=0.58)和甲醇含量(B=0.34)对总分离度呈正向影响,而进样量(C=-0.21)轻微负向作用。二次项系数(A2=-1.16、B2=-0.99、C2=-0.65)均为负值,表明3因素均存在最优值,超过阈值后分离度下降。交互项AB(-0.45)、AC(-0.32)、BC(-0.28)的负向作用显著,提示高pH与高甲醇比例、高pH与高进样量、高甲醇与高进样量的组合均会削弱分离效率。根据二次回归模型分析绘制其响应面和等高线图(图2)。

通过响应面模型预测,最佳条件为A=6.7、B=13%、C=28 μL,理论总分离度R=11.6。实际验证实验中,总分离度R=11.4±0.3(n=3),相对误差1.7%,6种形态砷分离度均大于1.5,保留时间重复性RSD<2.5%。模型优化结果与实验数据吻合程度很高。

2.2 不同形态砷的色谱分离效果

按照1.4所示色谱和质谱工作条件,对配制的浓度为20 μg/L的6种形态砷标准溶液上机检测,所得色谱图如图3所示。可以看出,通过合理选择色谱柱和流动相种类,控制合理的流动相流速,并采用梯度洗脱程序可以实现对水中6种形态砷的有效分离,分离度R>1.5,各种形态砷色谱峰强度均在2 000 cps以上,6种形态砷其保留时间分别为2.05、3.88、4.53、6.15、7.16和9.92 min。

2.3 方法验证结果

2.3.1 线性范围与相关系数

为了验证HPLC-ICP-MS测定环境地表水6种形态砷(As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsB、AsC)的适用性,对每种形态砷在0～100 μg/L浓度范围内的线性相关性进行系统考察。通过配制一系列浓度梯度的标准溶液,并测定其对应的响应信号,获得了每种形态砷的线性方程和相关系数。表5列出了6种形态砷的线性方程式及其相关系数。结果显示,在0～100 μg/L的浓度范围内所有形态砷均展现出良好的线性关系,相关系数R2均大于0.997,显示出该方法的高准确性和可靠性。

2.3.2 检出限与定量限

针对As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB、AsC和 As(Ⅴ)这6种形态砷,通过逐级稀释标准溶液,并以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限(Limit of Detection,LOD),以10倍信噪比(S/N=10)确定定量限(Limit of Quantification,LOQ)。结果如表6所示。

从表6可以看出,各形态砷的检出限和定量限均较低,6种形态砷的检出限为0.06～0.17 μg/L,定量限为0.20～0.57 μg/L,均远低于环境地表水中形态砷的常规浓度范围,表明本研究建立的方法在环境地表水样品分析中具有很高的灵敏度和准确性。

2.3.3 准确度与精密度

采用加标回收实验的方法,分别向6种形态砷浓度已知的地表水样品中加入两个不同浓度的加标量(5和20 μg/L),按照实验方法进行前处理和分析,每个加标量的水样重复测定6次,地表水样品6种形态砷背景浓度、元素回收率和相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)数据如表7所示。

实验结果显示,各形态砷的加标回收率均在95.4%～104.7%之间,表明该方法的准确度较高,各形态砷的RSD值均在6%以内,显示出该方法具有良好的重现性和精密度。

2.4 实际水样中形态砷的分析

从5个环境地表水样采样点(分别记为A、B、C、D、E)采集水样并进行As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB、AsC形态砷的定量分析,表8列出了不同采样点各形态砷的具体浓度。

从表中可以看出,两种无机砷As(Ⅲ)和 As(Ⅴ)是环境地表水的主要形态砷,占总砷的比例均超过60%,其中采样点C、D、E中无机砷占总砷的比例超过80%;在采样点B中,除了无机砷外,还检测到了一定浓度的DMA和MMA。环境地表水6种形态砷的含量约占地表水总砷含量的98%以上。

3 结论

建立了响应面法(RSM)优化的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用(HPLC-ICP-MS)分析方法,用于环境地表水中6种形态砷(As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB、AsC)的高效分析。实验表明,流动相pH与甲醇比例的交互作用对分离效率影响显著,优化后条件(pH 6.7、甲醇13%、进样量28 μL)使总分离度达11.4±0.3,6种形态砷在12 min内实现高效分离。方法验证实验结果证实了该方法具有良好的线性关系,所有形态砷在0～100 μg/L浓度范围内的相关系数R2均大于0.997;6种形态砷的检出限和定量限在0.06～0.17 μg/L和0.20～0.57 μg/L之间;加标回收实验显示各形态砷的回收率在95.4%～104.7%之间,RSD值均在6%以内。运用该方法对实际环境地表水样进行分析结果显示,无机砷As(Ⅲ)和As(Ⅴ)是环境地表水的主要形态砷。

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