三尖杉,是一种常绿的、雌雄异株的针叶树或灌木,属于三尖杉科(又称粗榧科)。主要分布于亚洲南部和东部[1],其具有极好的药用价值。三尖杉类植物中有许多次级代谢产物,主要分为生物碱类和萜类。三尖杉萜类天然产物具有很好的生物活性,自首个三尖杉生物活性分子分离以来,三尖杉化合物家族发展不断壮大。三尖杉碱天然存在于粗榧科三尖杉属植物的茎中,属生物碱的一种,具有抗癌作用,特別是对慢性血癌治疗效果显著。自1954年报道三尖杉类植物含有生物碱以来[2],至今已有近一百多个三尖杉生物碱已成功被分离。
三尖杉生物碱是一种从三尖杉科植物中分离出来的生物碱,具有显著的抗肿瘤活性。这些生物碱主要包括三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱等[3],其中三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱是三尖杉类植物中的主要活性成分,在临床上主要用于治疗白血病以及红斑狼疮等疾病[4]。美国食品和药物管理局批准三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱用于治疗多种酪氨酸激酶抑制剂耐药的慢性或加速期慢性髓系白血病[5]。高三尖杉酯碱(Homoharringtonine)可通过抑制蛋白质合成,诱导白血病细胞凋亡,常与干扰素或化疗联用,临床前研究显示对部分肺癌、乳腺癌细胞系具有生长抑制作用,目前处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段。最新研究提示可能通过干扰病毒RNA复制抑制SARS-CoV-2(体外实验EC50≈1.5 μmol/L),目前未进入临床验证阶段。
目前已从三尖杉属植物中提取分离出了三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱供临床应用,但由于三尖杉植物资源有限,其中有抗癌活性的酯类生物碱的含量又极低,远不能满足临床需要。除了资源制约外,落后的三尖杉生物碱分离检测技术一直是限制三尖杉植物得到高效利用的重要因素。目前一般采用的是酸碱梯度分离、氧化铝(或硅胶)柱层析结合逆流分配法进行反复分离。该方法流程长、操作繁琐、分离效率较低,而且其有机溶剂用量大、回收困难并且大多对环境污染严重。因此,寻找新的三尖杉植物资源、开发新的三尖杉生物碱提纯分离技术、化学合成三尖杉化合物对深入研究三尖杉生物碱、提高有限资源利用率具有十分重要的意义。
至今,科研工作者已提取分离出30～40种生物碱,包括粗榧碱类粗榧碱型12种,其中有药理活性的6种,它们是三尖杉酯碱(HT)、异三尖杉酯碱、脱氧三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱(HHT)、新三尖杉酯碱和脱水三尖杉酯碱。粗榧碱类氧型粗榧碱6种,均无药理活性。刺酮类台湾三尖杉碱型3种,无药理活性。高刺酮类施汉墨碱型10种,均无药理活性。海南粗榧碱3种有药理活性,它们是海南粗榧内酯、海南粗榧内酯醇和海南粗榧新碱。这些生物碱的存在,除与原植物的种类有关外,也与植物的地理分布、生长时间等有关。大体上,三尖杉含总生物碱量在树皮中含0.1%～0.45%,叶和枝中含0.2%～0.7%,其中约50%为粗榧碱,酯碱的含量非常低。
2000年,Chang等[6]研究了甲醇、水在超临界CO2(SC-CO2)中的作用,以提高超临界流体萃取三尖杉叶中三尖杉生物碱的提取效率。在所采用的改性剂中,与其他改性剂相比,乙二胺碱化甲醇大大提高了萃取效率。结果表明,通过碱化改性剂,植物基质中的三尖杉生物碱很容易从SC-CO2不溶性盐转变为SC-CO2可溶的游离碱。此外,与传统的有机溶剂萃取相比,碱化甲醇改性SC-CO2可使三尖杉生物碱的萃取效率提高30%以上。
2019年,Li等[7]通过研究添加代谢抑制剂来调节三尖杉生物碱合成的代谢通量,以提高产量。添加适当浓度的代谢抑制剂可以抑制初级代谢,促进底物和能量从初级代谢向次级代谢转化,最终有利于三尖杉碱的产生。研究表明L-丙氨酸、L-环己基丙氨酸和D-丙氨酸均促进了三尖杉悬浮细胞中三尖杉碱的生物合成,但L-环己基丙氨酸的作用最有效,且优于另一种抑制剂。
2021年,Luo等[8]从三尖杉种子中分离得到6例新的三尖杉生物碱,包括5个三尖杉碱型生物碱和1个赤藓碱型生物碱,以及6个已知的类似物。本次研究丰富了三尖杉生物碱的化学多样性,同时也为其生物起源假说提供了支持性证据,即三尖杉生物碱可能是由苯乙基异喹啉衍生物形成的生物遗传学假说提供了支持证据。
2021年,Kong等[9]对红豆杉种子的生物碱成分进行了深入研究,获得了一对结构独特的生物碱,具有结构新颖的7-氮杂四环三烷基核心,以及两个异构体通过多光谱技术确定了其结构。化合物对CR-葡萄糖苷酶具有抑制作用。
2021年,Li等[10]从三尖杉的枝叶中分离得到8个三尖杉类生物碱,通过5种光谱分析方法对其结构进行了鉴定,并与已知类似物的数据进行了比较。通过电子圆二色性(ECD)计算确定了其构型,各化合物对人组织细胞淋巴瘤细胞均有不同程度的抗增殖作用。结果表明,三尖杉类生物碱值得深入研究,可以通过修饰结构获得候选化合物,开发出新的抗白血病药物。
2022年,Bai等[11]从三尖杉的细枝、叶和种仁中分离得到22种三尖杉碱生物碱和10种赤藓碱型生物碱,其中7种为未报到过的生物碱。通过光谱分析、单晶X射线衍射和ECD计算方法确定了其结构,该工作研究了7种新生物碱的分离和结构解析并对人类白血病细胞系(THP-1和K562)的抗增殖活性进行了评估。结果表明所有化合物对THP-1和K562细胞均有不同程度的抑制增殖作用,值得作为开发新型抗白血病药物的先导化合物进行深入研究。
三尖杉生物碱的全合成是有机化学领域的研究热点之一。由于其复杂的结构,全合成具有很大的挑战性。化学家们已经探索了多种合成路线,例如以简单的环状化合物为起始原料,通过多步反应构建三尖杉生物碱的四环母核结构,再引入侧链得到目标产物。其中涉及到的反应包括环加成反应、氧化还原反应等。
2019年,Beaudry等[12]合成了一种高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱。它的氧化开环揭示了其发生跨环曼尼希环化反应。该反应在一次操作中以60%的收率建立了完整的三尖杉碱类生物碱亚结构。Noyori还原可以合成具有优异对映选择性的目标化合物。
2021年,Kim等[13]报道了用手性脯氨酸作为起始原料和唯一手性源合成不对称三尖杉生物碱。以L-脯氨酸为原料,经过8步反应,以高度立体选择性的方式合成了一个四环中间体,包括非对映选择性烷基化、立体特异性史蒂文斯重排和不寻常的O-酰基氧羰基中间体的分子内傅克反应。从一个常见的中间体开始,通过一系列氧化态调整完成了6个三尖杉生物碱的不对称全合成。
2021年,Sakai等[14]报道了一种新的金催化双环化过程反应的发现,该反应涉及乙烯基铵环化、Aza-Cope重排和曼尼希环化。以AuCl(PPh3)/Ag[Cs(CN)s]为催化剂体系,由简单环叔胺制备了多种融合氮杂环。该反应被用于合成三尖杉碱的研究。以去甲肼为原料,经5步操作得到去甲基三尖杉碱,总收率为39.1%;经过两步转化为三尖杉酯碱。
2021年,Kong等[15]研究了三尖杉酯碱的合成,对内酯和烯丙基位置进行修饰,得到17个衍生物。对4种肿瘤细胞系(HCT-116(人结直肠腺癌细胞)、A375、A549和Huh-7)和1种正常细胞系(L-02)进行了体外抗增殖活性试验。在这些新型衍生物中,有一化合物能够抑制细胞生长,并且在Huh-7(人类肝细胞癌细胞)和L-02细胞之间具有更好的选择性指数。结果表明,三尖杉内酯部分对细胞活性至关重要,这为进一步优化三尖杉酯碱结构提供了有益的信息。
2022年,Zhang等[16]研究开发了手性Ru[DTBM-SegPhos](OAc)2催化剂合成三尖杉酯碱酯。这种金属催化的不对称氢化反应使得以手性2′-取代琥珀酸4-单甲酯为侧链的新型三尖杉类生物碱衍生物的成功合成。初步研究了化合物抗肿瘤活性的构效关系。最终,发现化合物对白血病具有有效的抗肿瘤活性,对一组癌细胞具有广泛的抗肿瘤活性。他们的研究提供了一个高度对映选择性的过程,使三尖杉酯碱生物碱衍生物的半合成成为可能。
癌症是一种很复杂的慢性疾病,其特征是细胞的异常生长和分裂,是在全球范围内导致死亡的主要原因之一[17,18]。从天然产物中所提取出的生物碱具有良好的抑制癌细胞生长和扩散作用,因此研究者们发现这一特点并继续利用这种丰富的分子支架来源。从天然产物中寻找新药或先导化合物的研究是当前国内外创制新药的重要研究方向。天然产物提供的分子多样性和生物活性具有其独特的性质,是创制新药不可替代的源泉。
科研工作者从三尖杉植物中获得了多种有趣的次生代谢物,如黄酮类化合物、生物碱、萜类化合物和木脂素。值得注意的是,三尖杉酯碱对几种人类癌细胞系,特别是白血病细胞系显示出广泛而显著的细胞毒性作用。自1990年以来[19,20],两种具有代表性的三尖杉碱,三尖杉酯碱(HT)和高三尖杉酯碱(HHT)在中国临床应用于治疗急性非淋巴细胞白血病和慢性髓系白血病,还被用于治疗咳嗽、炎症、蛔虫病和消化不良中草药。
2008年,Dai等[21]在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠身上研究了三尖杉提取物的降血糖和降血脂活性。结果发现,三尖杉衍生物的乙酸乙酯部分能显著降低升高的血糖水平、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇,并能显著增加体重和高密度脂蛋白胆固醇水平(P<0.01)。结果表明,三尖杉治疗糖尿病大鼠可以改善STZ(Streptozotocin,链脲佐菌素)诱导的糖尿病大鼠肾功能受损,抑制肝损害,有良好的降血糖和降血脂作用,既能降低高血糖水平,又能降低高密度脂蛋白。根据实验证明,它是开发新的植物治疗剂的有价值的候选物。
2008年,Hata等[22]研究了三尖杉碱(CEP)对骨髓瘤细胞的直接抗肿瘤作用。在所有测试的骨髓瘤细胞系中观察到抗肿瘤作用,包括对三尖杉碱耐药的细胞系。暴露于CEP的骨髓瘤细胞系诱导活性氧的产生,激活caspase-3(蛋白酶)途径,最终诱导细胞凋亡。将细胞预先暴露于抑制剂Z-VAD-FMK(一种蛋白酶抑制剂)或自由基清除剂铁中,可有效阻断CEP诱导的细胞凋亡。值得关注的研究结果是CEP通过诱导CDK(表皮生长因子受体)抑制剂抑制骨髓瘤细胞的生长。这些数据首次表明,CEP通过激活凋亡通路和通过CDK抑制剂阻断细胞周期进展而具有抗骨髓瘤作用。
2019年,Song等[23]研究了三尖杉酯碱(HT)和高三尖杉酯碱(HHT)在体外能够有效抑制水痘带状疱疹病毒(VZV)的复制。研究表明,这些化合物的抗VZV活性优于常用的抗病毒药物阿昔洛韦(Acyclovir)。关于三尖杉酯碱对水痘带状疱疹病毒的具体抑制机制,研究结果显示,HT和HHT通过降低VZV的复制来发挥作用,而CET则没有显示出抗VZV的效果。通过文中数据表明,三尖杉酯类化合物在抗VZV活性方面具有显著的优势。
2020年,Ho等[24]研究了三尖杉酯碱(CET)对Zika病毒(ZIKV)感染的抑制作用。研究发现,CET是一种从三尖杉中提取的生物碱,能够在体外有效抑制ZIKV的活性。CET抑制ZIKV感染的机制包括:具有病毒杀灭活性,减少病毒复制,抑制ZIKV的mRNA和蛋白质的生产。此外,研究还表明CET对登革病毒1至4型(DENV1-4)也具有抑制作用。综上所述,CET可能成为治疗ZIKV的有效先导化合物,并建议进一步研究和开发CET衍生药物,可能会有新一类抗病毒药物的出现。
2021年,Hua等[25]从高山三尖杉的枝叶中分离到8个三尖杉宁碱类生物碱,其中包括2个新化合物三尖杉宁碱A和B。通过5种光谱分析方法对其结构进行了鉴定,并与已知类似物的数据进行了比较。通过电子圆二色性(ECD)计算确定了A和B绝对构型。探究了其对2种人白血病细胞株(U937和HL-60)的体外抗增殖作用。各化合物对U937细胞均有不同程度的抗增殖作用,GI50(血糖生成指数)值为4.21～23.70。结果表明,可以通过修饰三尖杉化合物结构,开发出新的抗白血病药物。
2021年,Li等[26]为了提高三尖杉悬浮细胞中三尖杉碱的产量并探索其生物合成途径,分别用冠状碱和茉莉酸甲酯激发子处理细胞悬浮培养,并分析其转录组差异。结果表明,冠状碱能提高三尖杉悬浮细胞中三尖杉碱的含量。以1.0 pmol/L的冠状碱处理为最高6.75 mg/L,高于茉莉酸甲酯处理(4.29 mg/L)和对照(3.14 mg/L)。添加上述激发子24 h后活性增加。转录组分析表明,苯丙烷途径、莽草酸途径、葡萄糖代谢过程、苯丙氨酸和酪氨酸合成途径参与了三尖杉碱的合成。此外,还发现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、己糖激酶、苯丙氨酸氨解酶(PAL)、细胞色素P450等与三尖杉碱积累密切相关。由此可见,冠状碱通过影响三尖杉碱合成途径中一些酶的表达,促进了三尖杉碱的合成。
2023年,Djaballah等[27]研究三尖杉酯类化合物,特别是高三尖杉酯碱及其衍生物在癌症治疗中的抗增殖活性,尤其是针对慢性髓性白血病(CML)和急性髓性白血病(AML)的潜在应用。研究表明,高三尖杉酯碱的半合成形式已被AML批准用于治疗对伊马替尼或其他酪氨酸激酶抑制剂耐药或不耐受的CML,文章探讨了高三尖杉酯碱(HHT)及其衍生物在不同白血病细胞系中的抗药性,发现这些衍生物能够克服多药耐药性,主要是因为它们的结构变化使其不易被转运蛋白排出。研究还发现,HHT及其衍生物对来自患者的原代白血病细胞表现出良好的敏感性,显示出低纳摩尔的效力。此外,文章还探讨了HHT诱导细胞死亡的机制,发现其通过Caspase 3(蛋白酶)的裂解导致细胞凋亡。总体而言,研究结果表明HHT及其衍生物在克服化疗耐药性方面具有潜力,为临床评估其在AML及其他癌症治疗中的应用提供了新的机会。
2024年,He等[28]对三尖杉碱核心结构进行氨基酸修饰,合成了7种新的衍生物。通过细胞活力试验和SARS-CoV-2(严重呼吸综合征冠状病毒)刺突假病毒进入试验对目标化合物进行评价。化合物CET-1显著抑制假病毒进入ACE2h(血管紧张素转化酶)细胞,其细胞毒性低于HT。分子对接结果表明,CET-1可以像HT一样结合ACE2的重要残基TYR83(酪氨酸酶)。总之,研究提供了一种新的化合物,在抑制SARS-CoV-2刺突假病毒感染方面比HT具有更大的潜在活性和更低的毒性,使得该结构有可能成为未来抗病毒药物的先导化合物。
三尖杉碱类化合物具有良好的抗肿瘤活性,现已成功应用于临床治疗相关疾病。本文总结了三尖杉碱具有良好的抑制癌细胞生长和扩散作用,特别是白血病细胞系,对水痘带状疱疹病毒,SARS-CoV-2刺突假病毒具有抑制作用等药用潜力。由于三尖杉植物资源的严重匮乏,其他有效的途径获得三尖杉碱类化合物变得异常重要。提取分离技术及结构的准确确定、化学合成途径都是有效获取三尖杉碱类化合物的重要途径。近年来,三尖杉生物碱的合成研究已经取得了一定的进展,通过全合成和半合成策略,化学家们能够构建出具有三尖杉生物碱母体结构的化合物。然而,仍然面临着立体化学控制、反应步骤复杂等诸多挑战。未来的研究需要进一步探索新的合成方法和策略,如开发更加高效的不对称合成反应、简化合成路线以及深入研究构效关系等。
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