过氧化氢脱硫辅助聚乙二醇法制备高凝胶性琼脂糖

琼脂主要是从石花菜、江蓠、鸡毛菜等红藻中提取的一种多糖。一般包括琼脂糖和琼脂胶两部分,其基本结构均为重复交替的1,3-连接的β-吡喃半乳糖和1,4-连接的3,6-脱水-α-L-吡喃半乳糖,琼脂糖含有很低含量的硫酸基团,呈电中性,是形成凝胶的重要组分,而琼脂胶为含有硫酸基、丙酮酸、甲氧基的酸性多糖,不会形成凝胶[1]。琼脂的凝胶性质使琼脂在食品加工及化妆品等行业得到广泛应用,常被用作胶凝剂、增稠剂、稳定剂等[2]。其中,硫酸基团是影响琼脂凝胶性能的主要因素。硫酸根含量高时,凝胶强度会降低。这是由于琼脂L-半乳糖C6的硫酸基团会在螺旋链中产生一个“扭结”阻碍螺旋的形成造成的[3]。因此,需要通过去除硫酸根来达到增加凝胶强度的目的。工业上除硫酸根是通过碱处理琼脂的传统方法,此方法能够将琼脂的大部分硫酸根脱除。用碱处理可以去除琼脂L-半乳糖C6位上的硫酸基团,形成更稳定的结构3,6-内醚,从而提高凝胶强度。另外,有机溶剂也可脱除硫酸根。Alfred等[4]使用二甲基亚砜、三甲基氯硅烷等化学方法能够除去藻类多糖存在的硫酸酯,且多糖骨架未发生显著降解,这一发现为琼脂的脱硫研究奠定了基础。近期有文献报道了酶法脱硫的方法,Wang等[5]使用酶处理琼脂,经红外、核磁、GC-MS、甲基分析等方法证实了酶法可以脱除琼脂D-半乳糖C4、C6和L-半乳糖C6位的硫酸根。Shukla等[6]从江蓠中提取出来的硫酸水解酶在pH 8、温度35 ℃达到最大活力,经酶处理琼脂后硫酸盐的清除率可达到60%以上,且琼脂具有更高的交联度和刚度。但目前酶法脱除硫酸盐的方法成本高,迫切需要开发一种成本低的脱硫方法。

过氧化氢(H2O2)是一种环保型试剂,广泛应用于造纸、电子、医药、环境处理、食品、航天等领域。在造纸行业中,过氧化氢作为漂白剂应用于纸浆漂白及藻类漂白中,其分解的HOO-是极强的亲核试剂,可以和色素反应,达到漂白目的[7-10]。过氧化氢分解后产生极自由基具有很强的氧化性,此性质在多糖改性中得到了广泛的应用,Yu等[11]通过控制过氧化氢与催化剂用量、反应的温度和时间来制备不同氧化程度的淀粉,并将其应用于皮革制造行业;Zhu等[12]通过控制过氧化氢的用量制备了不同氧化程度的卡拉胶,发现其微观结构由粗糙变光滑,并研究了其对革兰氏细菌的抗菌性;Zhang等[13]利用过氧化氢制备了不同氧化程度的氧化琼脂,发现其性质发生了不同程度的改变。在石油工业,为了防止石油燃烧产生二氧化硫污染大气,过氧化氢也常被用作脱硫剂减少污染[14]。前期研究中发现,过氧化氢对碱处理提取出来的琼脂粉有显著的脱硫效果,使琼脂的品质也得到了提升。

琼脂糖的制备主要是分离去除琼脂中琼脂胶的过程,目前分离纯化琼脂制备琼脂糖的方法主要有乙酰化法、季铵盐法、DEAE纤维素法、EDTA-Na2法、离子交换法、聚乙二醇法等,但乙酰化法过程操作复杂且会造成琼脂糖的降解和变色;季铵盐法则会导致引入的复聚物难以与琼脂糖溶液分离;而DEAE纤维素法仅适用于试验室规模的琼脂糖提纯,且价格昂贵,难以适用工业化生产[15]。

聚乙二醇(PEG)及其衍生物在生物制药领域应用前景广阔,PEG是美国食品药品监督管理局(FDA)批准能够直接用于人体临床注射的极少数聚合物之一[16],是一种绿色的化学溶剂。聚乙二醇法由于其操作简便、在提取与分离过程中成本低、提取产品纯度高且对环境污染小的特点,可以广泛应用于工业化生产。肖笛等[15]研究发现聚乙二醇沉淀法可有效分离精制琼脂糖,而孙宁等[17]使用聚乙二醇法从江蓠琼脂中提取了各项性能指标接近于Sigma琼脂糖的高品质琼脂糖。

本文以碱处理方法提取的琼脂粉为原料,采用过氧化氢为改性剂,以硫酸根含量为主要指标,凝胶强度为辅助指标,探究不同反应条件下(乙醇浓度、反应pH、H2O2添加量、反应时间和反应温度)过氧化氢的脱硫效果,优化最佳反应条件,然后以该琼脂为原料,采用聚乙二醇法进一步提纯琼脂糖,并与原琼脂粉做比较,分析基本性质(硫酸根含量、灰分、透明度、胶凝温度、融化温度、白度等)的变化,为脱硫琼脂应用到实际生产中提供理论支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

FE20K2型酸度计(瑞士梅特勒-托利多公司);BS233S型电子天平(德国赛多利斯公司);HH-4型电热恒温水浴锅(江苏金坛鸿科仪器厂);7200型分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);AI-SITE型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

琼脂(食品级,绿新(福建)食品有限公司);乙醇、盐酸、果糖、硫酸钾、氯化钡、间苯二酚(国药集团化学试剂有限公司);过氧化氢、氢氧化钠、明胶、乙缩醛(西陇科学股份有限公司);聚乙二醇6000(天津光复精细化工研究所)。除标注外,所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 琼脂脱硫工艺流程

配制250 mL一定体积分数的乙醇溶液,置于磁力搅拌器上,待溶液温度达到设定温度后加入25 g琼脂粉,添加一定量的30%过氧化氢溶液,调节琼脂溶液pH即为反应pH,反应结束后,添加1 mol/L的NaOH调节溶液pH至碱性(pH 8),纱布过滤,加入1 000 mL蒸馏水搅拌8 min,再过滤,反复洗涤至溶液pH接近中性,用过氧化氢检测试纸检测不到过氧化氢残留为止,55 ℃烘干,粉碎,过80目筛,得到样品。

1.2.2 琼脂脱硫工艺单因素试验

1.2.2.1 乙醇浓度

反应物琼脂添加量为25 g,过氧化氢的添加量为10 mL,反应温度为30 ℃,反应时间为2 h,反应pH 9,考察反应体系乙醇浓度对琼脂脱硫效率的影响。将琼脂分别加入40%、55%、70%、85%、100%乙醇浓度体系中进行反应,对反应后的样品进行凝胶强度及硫酸根含量测定。

1.2.2.2 H2O2添加量

反应物琼脂添加量为25 g,乙醇浓度体系为70%,反应温度为30 ℃,反应时间为2 h,反应pH 9,考察过氧化氢添加量对琼脂脱硫效率的影响。分别加入5、10、15、20、25 mL过氧化氢进行反应,对反应后的样品进行凝胶强度及硫酸根含量测定。

1.2.2.3 反应时间

反应物琼脂添加量为25 g,乙醇浓度体系为70%,过氧化氢的添加量为15 mL,反应温度为 30 ℃,反应pH 9,考察反应时间对琼脂脱硫效率的影响,分别反应1、1.5、2、2.5、3 h,对反应后的样品进行凝胶强度及硫酸根含量测定。

反应物琼脂添加量为25 g,乙醇浓度体系为70%,过氧化氢的添加量为15 mL,反应温度为 30 ℃,反应时间为2 h,考察反应pH对琼脂脱硫效率的影响。分别调节反应pH 3、5、7、9、11,对反应后的样品进行凝胶强度及硫酸根含量测定。

1.2.2.5 反应温度

反应物琼脂添加量为25 g,乙醇浓度体系为70%,过氧化氢的添加量为15 mL,反应pH 9,时间为2 h,考察反应温度对琼脂脱硫效率的影响。分别控制温度为30、40、50、60、70℃,对反应后的样品进行凝胶强度及硫酸根含量测定。

1.2.3 聚乙二醇法提取琼脂糖

1.2.3.1 琼脂糖提纯流程

取过氧化氢改性琼脂粉及原琼脂粉各15 g,另取375 mL蒸馏水在磁力搅拌器上加热至50 ℃后,将原琼脂及改性琼脂加入到蒸馏水中搅拌溶解,继续加热至80 ℃,使琼脂粉完全溶解至溶液状。在80 ℃恒温条件下,向溶解好的琼脂溶液中加入等体积(375 mL)的40%聚乙二醇6000溶液,搅拌混匀5 min产生沉淀,用干净纱布过滤,留沉淀。用40 ℃温水洗2～3次,洗去硫琼胶。常温的蒸馏水洗涤,浸洗8 h以除去聚乙二醇,用无水乙醚洗涤10 min,过滤,留沉淀;放入烘箱 55 ℃干燥。重复以上步骤2次即得原琼脂糖及改性琼脂糖。

1.2.3.2 琼脂糖产率

琼脂糖产率是指经过聚乙二醇法处理后中得到琼脂糖的质量比。

式中:产率为经过聚乙二醇沉淀处理后中得到琼脂糖的质量比,%;m1为加入聚乙二醇醇沉的琼脂质量,g;m2为聚乙二醇醇沉后所得琼脂糖质量,g。

1.2.4 硫酸根含量的测定

利用明胶-氯化钡法进行测定[18]。得到硫酸根含量计算的标准曲线方程为:Y=3.598 4X+0.002 1,R2=0.999 8。

称取0.3 g琼脂样品于25 mL比色管中,加入25 mL(1 mol/L)盐酸,于100 ℃水浴消化5 h后冷却至室温,活性炭脱色,过滤得澄清样品溶液待用。利用标准曲线方程计算琼脂中硫酸根含量,硫酸根计算公式为:

式中:A为样品吸光度值;b为标准曲线方程的截距;k为标准曲线方程斜率;m为消化样品质量,g。

1.2.5 凝胶强度的测定

配制1.5%琼脂溶液,微波溶解3 min,结束时补水恒重,冷却后盖保鲜膜,室温下静置过夜。将培养皿放在托盘天平的左方,将截面积为1 cm2的柱塞恰好接触凝胶表面后固定,天平右方放置烧杯,匀速加入蒸馏水,当凝胶表面破裂后立即停止加水,记录蒸馏水的总重量。

式中:M为蒸馏水的总重量,g;S为柱塞截面积,cm2。

1.2.6 白度的测定

样品先过80目筛,白度色度计提前预热 30 min,用黑板调黑,再用白板调白,之后测量样品,记录白度值。

1.2.7 透明度的测定

配制1%的琼脂溶液,配制完毕后立即倒入比色皿中,室温静置过夜,于700 nm下测定琼脂凝胶的透明度。

1.2.8 胶凝温度及融化温度的测定

配制1.5%的琼脂溶液,取10 mL加入放有玻璃珠的试管中,上下倾斜直至玻璃珠不再移动,立即插入温度计记录胶凝温度;融化温度是在已经形成凝胶的试管上放置一个钢柱,置于水浴锅中,从50 ℃以1 ℃/min升温,直至钢柱掉落,记录温度。

1.2.9 灰分含量的测定

参考GB 5009.4—2010《食品安全国家标准:食品中灰分的测定》[19]测定琼脂中的灰分:1)坩埚用1 mol/L的盐酸溶液浸泡24 h,105 ℃烘干 4 h,放入干燥器冷却至室温;2)坩埚称重,记为m2(精确到0.000 1 g),加样3 g左右,再次称重,记为m3;3)用电炉对样品进行炭化至无烟;4)将坩埚放入马弗炉中,在550℃下灼烧 4 h,冷却至200℃取出,放入干燥器中,冷却至室温后称重,记为m1;5)琼脂中的灰分含量计算公式如下:

2 结果与讨论

2.1 过氧化氢改性琼脂脱硫效果单因素条件优化

2.1.1 乙醇浓度对琼脂脱硫的影响

乙醇浓度对琼脂脱硫的影响结果如图1所示。

由图1可知,随着无水乙醇浓度的增加,琼脂硫酸根的脱除率呈先增加后下降的趋势。主要原因是琼脂的多羟基结构导致琼脂颗粒在水中时,琼脂分子之间的间隙会被水分子填充,发生溶胀,限制了过氧化氢与其接触反应。因此,适当增加乙醇浓度有利于琼脂颗粒在体系中分散,增大与过氧化氢接触机率,进而有效进行硫酸根的脱除。而凝胶强度随乙醇浓度的增加呈先下降后上升的趋势,这可能与过氧化氢在不同浓度的乙醇中分解的程度和速率有关,分解速率过快,导致部分参与氢键合成的羟基被氧化,氢键作用被破坏,减少了分子间的交联,从而降低凝胶的强度。当乙醇浓度为70%时,硫酸根脱除率最高,这可能与乙醇对过氧化氢的分解产物羟自由基(HO·)的猝灭作用有关[20]。而当乙醇浓度>70%,过高的乙醇浓度会抑制过氧化氢的分解,影响过氧化氢与琼脂的脱硫反应,进而导致琼脂的凝胶强度在乙醇浓度100%下达到最大值,硫酸根脱除率最低。以硫酸根含量为主要质量指标,结合凝胶强度指标。故选取乙醇浓度70%进行下一个单因素的优化。

2.1.2 过氧化氢添加量对琼脂脱硫的影响

过氧化氢添加量对琼脂脱硫的影响结果如图2所示。

由图2可知,随着过氧化氢添加量的增加,琼脂的硫酸根脱除率先上升后下降,这是因为在弱碱性条件下,随着过氧化氢添加量的增加,产生的HO·增加,与琼脂分子中的硫酸根接触机率增加,脱硫效果就越好。在过氧化氢添加量为15 mL条件下,琼脂的硫酸根脱除率最高,达到45.4%。凝胶强度则随过氧化氢添加量的增加而上升,当过氧化氢添加量为20 mL时,凝胶强度达到最大值。继续添加过氧化氢时,可能会产生降解,副反应明显,硫酸根脱除率降低,凝胶强度也随之降低,这是由于过氧化氢的氧化性较强,易与琼脂分子中的糖苷键发生反应,造成琼脂降解,导致琼脂的凝胶强度下降。因此,综合硫酸根脱除率和凝胶强度指标,过氧化氢改性琼脂的最佳过氧化氢添加量为15 mL。

2.1.3 反应时间对琼脂脱硫的影响

反应时间对过氧化氢改性琼脂的影响结果如图3所示。

反应时间过短会使琼脂分子与过氧化氢分子接触不充分,降低脱硫效率,反应时间过长,反应达到平衡,降低反应效率。由图3可知,随着反应时间的增加琼脂硫酸根脱除率增加,凝胶强度随反应时间的延长先上升后趋于稳定最后下降。当反应时间达到2 h后,琼脂的硫酸根脱除率最高为36.4%,此后再延长反应时间琼脂的硫酸根脱除率随之下降,这主要是较短时间内,过氧化氢与琼脂分子的活性基团无法充分结合,反应不完全,此时,过氧化氢分子分解过程中可能产生自由基,自由基能够攻击琼脂分子,造成琼脂分子降解,琼脂凝胶强度降低。适当延长反应时间,过氧化氢分子与琼脂分子中的活性基团充分结合,随后反应达到平衡状态,因此硫酸根脱除率逐渐增加,琼脂的凝胶强度先增加后趋于稳定。而反应时间过长,琼脂分子在反应液中易溶胀,影响反应进行。综合凝胶强度指标,过氧化氢改性琼脂的最佳反应时间为2 h。

2.1.4 反应pH对过琼脂脱硫的影响

过氧化氢在水溶液中易分解成H2O和O2,这是多项化学分解和反应的平衡,涉及多种离子和自由基。因此当反应环境酸碱不同时,反应体系离子和自由基比例含量发生变化,导致反应结果存在较大差异。反应pH对过琼脂脱硫的影响结果如图4所示。

由图4可知,在pH为酸性或碱性条件下,硫酸根脱除效率较高,在中性条件下,硫酸根脱硫率最低,这主要是H2O2在酸性或弱碱性条件下易分解,且溶液酸碱性越强,过氧化氢的分解速率越快[21]。因此在pH 3、9时硫酸根脱除率最高,分别达到20.6%和19.8%。凝胶强度随pH增加而增加,这与琼脂在酸性条件下会发生降解有关。当增加至pH 11时,琼脂的硫酸根脱除率下降,其中原因可能是碱性过强时,过氧化氢分解大量的

此基团可以与琼脂分子中的色素反应,达到漂白的效果,但脱硫率下降[7]。综合考虑,选择pH 9作为反应最适pH。

2.1.5 反应温度对琼脂脱硫的影响

反应温度对琼脂脱硫影响结果较为显著。温度的变化不仅对琼脂结构有影响,而且对过氧化氢分解速率也有影响。反应温度升高时,反应速率增加,但当温度过高时,琼脂在反应过程中会发生吸水溶胀,不利于反应的进行。反应温度对琼脂脱硫效果的影响结果如图5所示。

由图5可知,当反应温度从30 ℃提高到50 ℃时,硫酸根脱除效率大幅度提高,这可能是因为低温环境下分子运动不活跃,导致过氧化氢分子和琼脂分子之间接触效率不高。随着反应温度的提高,分子运动开始变得活跃,过氧化氢分子与琼脂分子的接触反应效率大幅度提高,琼脂的凝胶强度也随之增加。而反应温度升高至70 ℃时,会造成过氧化氢无效分解,失去其原有的性质,琼脂分子在高温时吸水溶胀现象更加明显,所以在该温度下无法进行氧化脱硫,且温度升高会使部分琼脂分子溶解在水中,发生降解,凝胶强度下降到最低值。因此,选择50 ℃为最佳反应温度,此时改性琼脂的硫酸根脱除率最高为18.4%,硫酸根含量最低为0.21%。

2.1.6 聚乙二醇法提取琼脂糖品质分析

通过单因素实验确定了最佳过氧化氢改性琼脂的条件,利用最优工艺改性琼脂。利用聚乙二醇法提纯琼脂糖,测定其产率及主要质量指标。如表1所示,与原琼脂相比,改性琼脂的白度提高了14.38%。白度的增加是因为过氧化氢在反应过程中会分解出过羟基阴离子(HOO-),此离子是一种极强的亲核试剂,能够与琼脂分子中色素的共轭体系发生反应,从而使琼脂的白度增加。琼脂中的灰分是高温灼烧后残留的无机盐,主要成份是硫酸盐,其含量变化应该与硫酸根是一致的,可以看出,改性琼脂的灰分含量和原琼脂相比显著降低,而经聚乙二醇提纯后的原琼脂糖,硫酸盐及灰分含量进一步降低。经过氧化氢改性后的琼脂强度略有下降,这主要是琼脂在加热状态下会发生部分降解导致。与原琼脂和改性琼脂相比,使用聚乙二醇法制得的原琼脂糖和改性琼脂糖在硫酸根含量上都有所下降,琼脂糖强度显著增加,胶凝温度及融化温度也有一定程度的提高,且灰分含量显著降低,这说明聚乙二醇法提纯琼脂糖可以有效缓解琼脂在过氧化氢脱硫阶段发生的水解作用,进一步有效提高琼脂糖的强度和纯度。

3 结论

以琼脂的硫酸根含量和凝胶强度为指标,通过单因素试验考察无水乙醇浓度、过氧化氢添加量、反应时间、反应pH、反应温度优化得出过氧化氢改性琼脂的最佳条件为:无水乙醇浓度70%,过氧化氢添加量15 mL,反应时间2 h,反应pH 9,反应温度50 ℃。在此条件制备得到过氧化氢改性琼脂的硫酸根含量为0.21%、凝胶强度为966.6 g/cm2。将优化工艺制得的琼脂用于提取琼脂糖,制备的琼脂糖其硫酸根含量为0.19%,凝胶强度为1 244.9 g/cm2。该结果说明经过过氧化氢改性的琼脂脱硫效果明显、效果稳定,适合用于作为提取琼脂糖的原料,为提取琼脂糖节约了成本,适合扩大生产。

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