灰茅根Pennisetum longissimum S.L.Chen et Y.X.Jin var.intermedium S.L.Chen et Y.X.Jin为禾本科植物变异狼尾草的干燥根茎,现收载于《甘肃省中药材标准》,主要分布于甘肃省陇南市徽县等地。灰茅根味甘,性凉,具有清热,止咳,止痛等药理作用,主要用于鼻塞,流涕,咽喉疼痛,牙痛,血痨等症[1]。灰茅根药用价值显著,目前未有对其化学成分进行较为系统且全面的分析鉴定研究报道,研究潜力较大。
历年本草中皆有关于“茅根”的记载,大多为禾本科植物[2]。《本草蒙筌》中“下淋利小便,通闭逐瘀血”;《本草易读》中“止吐衄诸血,除淋沥客热。黄胆水肿皆疗,哕呕喘急悉医。利小便而止消渴处处有之”;《本草择要纲目》中“劳伤虚羸,补中益气,除瘀血血闭寒热,利小便,下五淋”等。狼尾草最早载于《本草拾遗》,甘肃陇南徽县的一种民间药用的狼尾草与历史记载的茅根相似,经专家鉴定为禾本科中型狼尾草的干燥根茎。
UPLC-Q-TOF-MS/MS技术集超高效液相色谱的高效分离能力和飞行时间质谱的高分辨特性为一体,实现了对中药材复杂成分的快速分离和鉴定,目前被广泛应用于中药及复方的化学成分分析鉴定[3]。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对灰茅根的化学成分进行系统性地分析,为进一步研究灰茅根的药效物质基础及质量控制研究提供科学依据。
1 实验部分
1.1 主要仪器及试剂
Agilent 1290型超高效液相色谱串联6546Q-TOF高分辨质谱仪(美国Agilent公司);METTLER TOLEDO ME204型、METTLER TOLEDO MS205DU型分析天平(瑞士梅特勒公司);KQ-500DE超声波清洗器(上海超声波仪器厂)。
灰茅根药材由甘肃省陇南市徽县中医院提供,由兰州大学生命科学学院植物分类学专家蒲训教授鉴定灰茅根Pennisetum longissimum S.L.Chen et Y.X.Jin var.intermedium S.L.Chen et Y.X.Jin为禾本科植物变异狼尾草的干燥根茎。
甲醇、乙腈(质谱级,德国默克医药生物有限公司);甲酸(质谱级,北京迪马科技有限公司);屈臣氏蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 供试品溶液的制备
灰茅根药材经粉碎后过五号筛,精密称取两份约4 g粉末,置于锥形瓶中,按照料液比1∶10分别加入20 mL甲醇和水,超声提取30 min,冷却至室温,补足质量。将两份样置于同一锥形瓶,混匀。混合后的样品用15 000 r/min离心10 min,取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。
1.2.2 色谱条件
采用Waters ACQUITY UPLC® BEH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱,以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0～1.5 min,0～5% B;1.5～10 min,5%～20% B;10～15 min,20%～40% B;15～20 min,40%～60% B;20～25 min,60%～80% B;25～30 min,80%～95% B;30～35 min,95% B;35～40 min,95%～5%;40～45 min,5%)。流速为0.3 mL/min,柱温40 ℃,进样量3 μL。
1.2.3 质谱条件
采用电喷雾离子源,正、负离子模式扫描auto MS/MS,质量扫描范围50～1 200 m/z;气体温度325 ℃,干燥气流12 L/min,雾化器压力45 psi,鞘气温度325 ℃,鞘气流速11 L/min,毛细管电压3.5 kV,fragmentor电压120 V;碰撞能量0 V和 15 V,数据采集45 min。
1.2.4 样品的采集
按照1.2.1方法进行样品的制备,按1.2.2和1.2.3的检测条件进行测定。采用MSMS模式进行数据采集。
1.2.5 数据的分析
通过Agilent MassHunter和Qualitative Analysis软件进行数据和处理,如保留时间校准、峰识别和峰提取等,经人工筛选出最终结果。将测得化合物通过碎片离子质谱图及其裂解途径、比对相关文献进一步确证。
2 结果与讨论
根据质谱得到的化学成分信息,运用Agilent相关软件筛选出目标化合物。根据保留时间、准分子离子峰、二级碎片等信息,结合Chemical Book(https://www.chemicalbook.com/)、ChemSpider(https://www.chemspider.com/)和化源网(https://www.chemsrc.com/)等数据库及参考文献鉴定相关化学成分。结果在灰茅根中共鉴定出41个化合物,其中萜类12个,苯丙素类9个,黄酮类5个,有机酸4个,醌类2个,生物碱2个和其他类7个。灰茅根中正、负离子模式的总离子流图,见图1,各分析结果见表1。
表1 灰茅根中鉴定出的41个化合物注
Tab.1 41 compounds identified in the root Pennisetum
tR/min离子模式理论值(m/z)实测值(m/z)误差分子式碎片离子(m/z)化合物名称来源1g1.21POS118.06805[M+H]+118.06813-0.56C5H11NO255.11647、71.07841、85.02951、101.02378缬氨酸(valine)[4,5]2c1.21NEG609.18247[M-H]-609.18544-4.88C28H34O15301.07235、343.11378、465.12415、489.14031新橙皮苷(neohesperidin)[4,6,7]3g1.65NEG134.04718[M-H]-134.04730-0.9C5H5N578.95942、92.02491、107.03560腺嘌呤(adenine)[5,6]4g5.14NEG203.08255[M-H]-203.082660.029C11H12N2O274.02530、116.04974、142.06498、159.09098L-色氨酸(L-tryptophan)[5,8,9]5a6.42NEG495.15078[M-H]-495.150290.982C23H28O12465.13510、165.05421、137.02315氧化芍药苷(oxypaeoniflora)[10,11]6a6.99POS541.15280[M+Na]+541.151791.867C22H30O1489.06445、177.06418、191.011996′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷(6′-O-β-D-Glucosylgentiopicroside)[12]7f7.38NEG169.01428[M-H]-169.014250.18C7H6O5125.02374、151.00542没食子酸(gallicacid)[10]8g9.298NEG163.04017[M-H]-163.040070.63C9H8O393.03459、117.03355、119.04951、163.03877邻羟基肉桂酸(o-hydroxycinnamicacid)[9]9a9.404NEG325.09287[M-H]-325.09294-0.216C15H18O8131.09910、195.11071、239.13166、257.09854白果内酯(bilobalide)[13]10c10.58NEG389.12417[M-H]-389.12423-0.16C20H22O8143.04911、185.05941、227.05360、340.01079虎杖苷(polydatin)[6]11b10.74NEG535.18208[M-H]-535.18259-0.96C26H32O12161.03025、178.06142、315.12454、329.13581、去甲络石苷(Nortracheloside)[14]12b10.97NEG221.04552[M-H]-221.04555-0.12C11H10O5162.98731、190.99714、206.02136异嗪皮啶(isofraxidin)[15]13a11.07NEG521.20301[M-H]-521.202860.28C26H34O11247.11346、443.17591、475.20586双氢鸦胆子苦醇(dihydrobrusatol)[16]14b11.11NEG147.04524[M-H]-147.045150.6C9H8O287.01950、129.03506二氢香豆素(dihydrocoumarin)[17,18]15b11.3NEG521.20281[M-H]-521.20282-0.015C26H34O11107.06084、285.14486、313.14324、328.16853二氢去氢二愈创木基醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷(Urolignoside)[19,20]16a12.99NEG187.09765[M-H]-187.097590.3C9H16O4101.03723、128.05107、171.09920杜仲醇(eucommiol)[21,22]17c13.28NEG355.11869[M-H]-355.11876-0.202C20H20O6151.04007、160.01736、190.06086、193.05102勒奇黄烷酮G(leachianoneG)[23]18c13.57POS415.18800[M+Na]+415.186164.443C25H28O489.04818、177.07540、233.10778光甘草酚(glabrol)[24]19b13.57NEG227.07130[M-H]-227.07136-0.25C14H12O3119.04883、135.04334、148.05154、175.08582川白芷素(angenomalin)[25]20d13.96POS403.16280[M+Na]+403.162500.744C22H24N2O4259.10733、299.11884、351.13205番木鳖次碱(vomicine)[24]21b14.15POS433.21480[M+H]+433.213233.637C24H32O7151.09235、177.11088、348.17630、415.22408五味子醇甲(wuweizialcoholA)[9]
续表
tR/min离子模式理论值(m/z)实测值(m/z)误差分子式碎片离子(m/z)化合物名称来源22d14.24POS411.17631[M+H]+411.17695-1.56C23H26N2O5327.11609、349.10068、379.14570、394.13409伪马钱子碱(pseudobrucine)[24]23a15.53NEG371.11360[M-H]-371.113280.87C20H20O7151.03982、267.07169、372.11482黄藤内酯(fibraurin)[23]24e16.06NEG329.06665[M-H]-329.066091.71C17H14O7135.04692、299.05303、315.05010、橙黄决明素(aurantio-obtusin)[7]25c16.6NEG269.04546[M-H]-269.04557-0.41C15H10O5136.54740、244.14665、262.159375-去羟山柰酚(resokaempferol)[26]26f17.13POS353.22980[M+Na]+353.229720.226C18H34O567.05771、81.07385、95.09022、107.09153、121.10701、133.10849三棱酸(sanlengacid)[16,18]27a20.04POS335.21441[M+H]+335.213233.514C20H30O4299.20457、317.2237414-去氧穿心莲内酯(14-deoxyandrographolide)[27]28b20.53POS439.17270[M+Na]+439.172330.842C23H28O7134.03633、167.06987、221.11807木兰脂素(magnolin)[4]29g20.7NEG367.11869[M-H]-367.118021.821C21H20O6134.03652、149.06054、160.01533、175.03892姜黄素(curcumin)[28]30g20.7NEG367.11789[M-H]-367.11853-1.73C21H20O6149.04297、163.06042、230.08706、246.08464环姜黄素(cyclocurcumin)[28]31e21.13NEG269.04552[M-H]-269.04558-0.21C15H10O5225.05423、237.10783、241.04799芦荟大黄素(aloeemodin)[7]32g21.35NEG313.23842[M-H]-313.23848-0.19C18H34O4141.08566、155.10269、226.12451、268.17226癸二酸二丁酯(dibutylsebacate)[29]33a21.453NEG191.07140[M-H]-191.071181.151C11H12O3145.03005、149.03209、163.03933细辛醚(asaricin)[8]34b22.74NEG265.12340[M-H]-265.123001.509C18H18O2223.07626、247.09547厚朴酚(magnolol)[4]35a26.95NEG455.35310[M-H]-455.352341.669C30H48O3265.24733、277.21530、314.22628、375.28497齐墩果酸(oleanolicacid)[30]36f27.38NEG277.21728[M-H]-277.217210.253C18H30O2157.14308、255.22898α-亚麻酸(linolenicacid)[31]37f28.8NEG279.23300[M-H]-279.23301-0.036C18H32O2221.15131、279.22973、280.23366亚油酸(linolicacid)[9]38b29.73NEG413.12407[M-H]-413.12424-0.41C22H22O8398.10167、413.12217、414.31457苦鬼臼毒素(podophyllotoxin)[9]39a29.73NEG577.37457[M-H]-577.37425-8.4C33H54O8149.06244、193.10683、381.23555、408.32922知母皂苷A1(timosaponinA-1)[22]40a33.99NEG619.42152[M-H]-619.421490.047C36H60O891.02121、413.33887、457.32427人参皂苷RH4(ginsenosideRH4)[31]41a34.83POS487.50821[M+H]+487.50837-0.325C31H50O4295.22667、349.27731、451.35982、469.32231土莫酸(tumulosicacid)[20,24]
注:a.萜类;b.苯丙素类;c.黄酮类;d.生物碱类;e.醌类;f.有机酸类;g.其他。
图1 灰茅根正(a)、负(b)离子模式下的总离子流图
Fig.1 BPI chromatograms of the root Pennisetum in positive (a) and negative (b) mode
2.1 萜类化合物的鉴定分析
萜类化合物是灰茅根中主要的化合物,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等药理作用[32]。结合对照品和相关文献,在灰茅根中共解析出10个萜类化合物,主要为单贴、三萜类和少量的二萜类化合物。单萜类以化合物5为例,在负离子模式下,保留时间为6.42 min,准分子离子峰为m/z 495.150 29[M-H]-,通过软件计算推测其化学式为C23H28O12,裂解时准分子离子峰丢失1个—CH2O形成碎片离子m/z 465.135 10[M-H-CH2O]-,接着Glucose(葡萄糖)、C7H6O3、H2O和CH2O、C2H4等中性分子再次丢失,形成m/z 165.054 21(蒎烷)和m/z 137.023 15(对羟基苯甲酸)的碎片离子,查阅文献[9,11]可知蒎烷和对羟基苯甲酸碎片离子为氧化芍药苷的特征碎片离子,以此推测该化合物为氧化芍药苷,见图2。
图2 氧化芍药苷的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.2 Secondary mass spectrogram(a) and possible fragmentation mechanism (b) of oxypaeoniflora
三萜类化合物在植物体内多与糖结合成苷或酯,在裂解过程中,环上—OH易丢失形成H2O,且糖苷键易断裂[33]。以化合物41为例,在正离子模式下,保留时间为34.83 min,准分子离子峰为m/z 487.508 37[M+H]+,推测化学式为 C31H50O4,裂解时依次脱去2分子H2O形成m/z 469.322 31[M+H-H2O]+、m/z 451.359 82[M+H-2H2O]+的碎片离子,继续丢失1个糖苷键,形成m/z 295.226 67[M+H-C9H16O2-2H2O]+碎片离子,查阅文献推测出该化合物为土莫酸[20,24]。
二萜类化合物多以丢失中性分子H2O为主,以化合物27为例,在正离子模式下,保留时间为20.04 min,准分子离子峰m/z 335.213 23[M+H]+,推测化学式为C20H30O4,二级碎片离子为m/z 317.223 74[M+H-H2O]+、m/z 299.204 57[M+H-2H2O]+,结合对照品和文献[27]比对,推测出该化合物为14-去氧穿心莲内酯,见图3。
图3 14-去氧穿心莲内酯的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.3 Secondary mass spectrogram(a) and possible fragmentation mechanism (b) of 14-deoxyandrographolide
2.2 苯丙素类化合物的鉴定分析
从灰茅根中共鉴别出苯丙素类化合物9个,其中包括7个香豆素类:二氢香豆素、异嗪皮啶、去甲络石苷、二氢去氢二愈创木基醇-4′-O-β-D-葡萄糖苷、五味子醇甲、川白芷素和苦鬼臼毒素;2个木脂素类:木兰脂素和厚朴酚。香豆素类在裂解过程中,先是丢失一些特有的取代基,接着吡喃环上的CO丢失,若取代基中有羟基,则多失去1分子CO,直至丢失全部的O[34]。
香豆素类以化合物12为例,化合物12在负离子模式下,保留时间为10.97 min,准分子离子峰为m/z 221.045 55[M-H]-,推测化学式为C11H10O5,裂解时依次脱去2分子—CH3,产生m/z 206.021 36[M-H-CH3]-、190.997 14[M-H-2CH3]-的碎片离子,接着丢失1分子CO,形成m/z 162.987 31[M-H-2CH3-CO]-的碎片离子,结合文献[15]推测其为异嗪皮啶,见图4。
图4 异嗪皮啶的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.4 Secondary mass spectrogram(a) and possible fragmentation mechanism (b) of 7-hydroxycoumar
木质素类以化合物34为例,在负离子模式下,保留时间为22.74 min,准分子离子峰为m/z 265.123 00,推测其化学式为C18H18O2,二级碎片有m/z 223.076 26[M-H-C3H6]+、m/z 247.095 47[M-H-H2O]+,结合对照品和文献[4]比对,推测出其为厚朴酚,见图5。
图5 厚朴酚的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.5 Secondary mass spectrogram(a) and possible fragmentation mechanism (b) of magnolol
2.3 黄酮类化合物的鉴定分析
黄酮类主要包括黄酮、二氢黄酮及其苷类,基本母核为2-苯基色原酮,C环相比于A环和B环易断裂。黄酮苷类的裂解规律通常是以RDA裂解、糖苷键的断裂和中性分子的丢失[35]为主。在灰茅根中共鉴定出5个黄酮类化合物,以化合物2为例,在负离子模式下,保留时间为1.21 min,准分子离子峰为m/z 609.185 44[M-H]-,推测其分子式为C28H34O15,准分子离子的糖苷键断裂,丢失1分子葡萄糖和1分子鼠李糖得到m/z 301.072 35[M-H-Rha-Glc]-;丢失—C10H18O8和—C4H8O4分别得到m/z 343.113 78[M-H-C10H18O8]-和m/z 489.140 31[M-H-C4H8O4]-的碎片离子,根据以上数据推测其为新橙皮苷[4,6,7]。化合物10在负离子模式下,保留时间为10.58 min,准分子离子峰为m/z 389.124 23[M-H]-,推测其分子式为C20H22O8,准分子离子丢失糖苷得到m/z 227.053 60[M-H-C6H10O5]-的碎片离子;接着连续丢失2分子—C2H2O,在A、B环间发生RDA裂解,形成碎片离子m/z 185.059 41[M-H-C2H2O]-和m/z 143.049 11[M-H-2C2H2O]-,推测其可能为虎杖苷[6],二者见图6、7。
图6 新橙皮苷的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.6 Secondary mass spectrogram (a) and possible fragmentation mechanism (b) of neohesperidin
图7 虎杖苷的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.7 Secondary mass spectrogram (a) and possible fragmentation mechanism (b) of polysweed
2.4 醌类化合物的鉴定分析
醌类化合物主要分为蒽醌、萘醌、菲醌和苯醌4种类型,在灰茅根中蒽醌类化合物有2个,分别为芦荟大黄素和橙黄决明素。研究表明蒽醌类化合物具有抗炎、抗血栓和利尿等药理作用[36],在裂解过程中,多为苯环上的取代基断裂。
以化合物31为例,化合物31在负离子模式下,保留时间为21.13 min,准分子离子峰为m/z 269.045 58[M-H]-,推测化学式为C15H10O5,裂解时先是失去苯环上的—CH2O取代基,得到m/z 241.047 99[M-H-CH2O]-碎片离子,接着在保留了共轭结构的基础上,继续失去一个O,得到m/z 225.054 23[M-H-CH2O-O]-碎片,通过查阅文献[7]推测出化合物31为芦荟大黄素,见图8。
图8 芦荟大黄素的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.8 Secondary mass spectrogram (a) and possible fragmentation mechanism (b) of of aloe-emodin
2.5 有机酸类化合物的鉴定分析
研究表明有机酸是植物体中的共有成分,具有抗炎症、抗氧化、抗血小板聚集等生物活性[37],从灰茅根中初步推测出可能含有没食子酸、三棱酸、α-亚麻酸和亚油酸。有机酸在负离子模式下响度较好,根据特征碎片—COOH连接的基团不同分为脂肪酸和芳香酸,两者在裂解过程中多丢失H2O和CO2等中性分子[38]。以化合物7为例,保留时间为7.38 min,准分子离子峰为m/z 169.014 25[M-H]-,推测化学式为C7H6O5,裂解时准分子离子峰丢失H2O、CO2分别得到m/z 151.005 42[M-H-H2O]-和m/z 125.023 74[M-CO2]-的碎片离子,结合文献[10]推测此化合物为没食子酸,见图9。
图9 没食子酸的二级质谱图(a)和可能裂解图(b)
Fig.9 Secondary mass spectrogram (a) and possible fragmentation mechanism (b) of of gallic acid
2.6 生物碱类化合物的鉴定分析
生物碱是一类具有碱性的有机化合物,具有复杂的环状结构,在环内大多含有N,有抗炎、抗病毒和抗肥胖的生物活性[39]。根据已有的数据库进行对比,推测出灰茅根中可能含有2个生物碱,分别为伪马钱子碱和番木鳖次碱。化合物22在正离子模式下,保留时间为14.24 min,准分子离子峰为m/z 411.176 95[M+H]+,推测分子式为C23H26N2O5,裂解时失去1分子H2O,形成m/z 394.134 09[M+H-H2O]+的碎片,接着失去1分子中性离子碎片得到m/z 379.145 70[M+H-H2O-CH3]+的碎片离子。结合文献[24]对比,推测其为伪马钱子碱。
2.7 其他类化合物的鉴定分析
从灰茅根中共推测鉴别出7个其他类化合物,包括两个氨基酸类:L-色氨酸、缬氨酸等。氨基酸类是一类既含有氨基又有羧基的化合物,在裂解过程中通常会丢失H2O、CO和COOH2等小分子,有时也会丢失—NH3[25]。以化合物1为例,在正离子模式下,保留时间为1.21 min,准分子离子峰为m/z 118.068 13[M+H]+,推测化学式为C5H11NO2,裂解时准分子离子峰陆续断裂—COOH-和
得到m/z 71.078 41[M+H-COOH]+、m/z 55.116 47[M+H-COOH-NH3]+的碎片离子,结合对照品和文献[4,5]推测其为缬氨酸。
3 结论
在实验的前期,本课题组对灰茅根供试品的提取和液质条件进行了优化,包括灰茅根的提取溶剂(水、50%甲醇、甲醇)、超声时间(30、60 min)、洗脱梯度等。结合实验结果、环境和经济的需求,最终确定纯甲醇超声提取30 min,以0.1%甲酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱。由于灰茅根化学成分较复杂,且不同成分在不同条件下响应强度不同,因此采用正负模式全扫描的形式进行分析。
本研究首次基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对灰茅根中化学成分进行了分析,共鉴定了41种化学成分,其中萜类12个,醌类2个,有机酸4个,苯丙素类9个,黄酮5个,生物碱2个以及其他7个。通过结果分析发现灰茅根中萜类、香豆素和黄酮类成分种类较多,以此推测这3类成分可能是灰茅根发挥药效的主要成分。而针对灰茅根中未知化合物,后续应经修饰转变为具有一定生物活性和药效作用的先导化合物。
本研究通过灵敏、快速的UPLC-Q-TOF-MS技术对灰茅根进行分析,首次系统性预测化学成分,为今后的药效物质基础与质量控制研究奠定了坚实的物质基础,也为其质量评价标准提供了科学理论支撑。
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