重组融合蛋白抗体偶联药物靶向EGFR结合自由能的探究

抗体偶联药物(ADCs)是将抗体的选择性与小分子药物的杀伤性相结合,从而精准识别杀伤肿瘤细胞,降低对正常细胞的毒性[1]。ADCs作为一种癌症靶向治疗药物,利用其靶向肿瘤过表达的表皮生长因子受体(EGFR)是一个很有吸引力的治疗策略。EGFR隶属于跨膜受体酪氨酸激酶(RTKs)家族,是一个含有1186个氨基酸的跨膜糖基化蛋白,由细胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及细胞内结构域这3个部分构成(图1)。其中胞外结构域由621个氨基酸组成,由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ这4个亚区构成[2],见图2。EGFR与配体(EGF)结合后在胞外发生二聚化,激活细胞内酪氨酸蛋白激酶,使C末端酪氨酸残基磷酸化,触发Ras、Raf、PI3K等下游酶,启动复杂交织的信号传导通路,以此调控细胞生长、分化与凋亡[3]。EGFR受体的过表达或突变会导致下游信号通路的失调,与多种表皮生长相关肿瘤的发病机理密切相关[4],是肿瘤靶向治疗的热门靶点之一。

力达霉素(LDM)由北京协和医学院甄永苏院士团队首次从链霉菌(C-1027)中分离,属于大分子烯二炔类抗肿瘤抗生素,由辅基蛋白(LDP)与极具细胞毒性的烯二炔发色团(AE)以非共价键结合而成[5]。人血清白蛋白(HSA)的结构域Ⅲ(D3)能增强巨噬细胞的内吞作用。何石明[6]通过克隆形成实验、EdU染色分析等方法证实了Fv-LDP-D3-AE对EGFR的过磷酸化及癌细胞的克隆增殖有很好的抑制作用,可在体外抑制癌细胞迁移,诱导自噬,破坏线粒体结构,阻滞细胞于G2/M周期,引发癌细胞凋亡,其中Fv是抗EGFR单链可变区片段。Wang等[7]通过ELISA和流式细胞术分析重组蛋白与EGFR蛋白和胰腺肿瘤细胞的结合活性中发现,重组蛋白Fv-LDP和Fv-LDP-D3与EGFR蛋白的结合效率高且一致,而LDP-D3组未检测到结合亲和力。通过噬菌体展示技术筛选的抗EGFR单链可变片段(scFv)和D3构建了一种新的重组蛋白Fv-LDP-D3-AE。

生物实验证实Fv-LDP-D3具有靶向EGFR和巨噬细胞强化的双功能,对肿瘤细胞有显著的增殖抑制作用,但其靶向EGFR并与之相互作用的机制尚不清晰。基于生物实验与生物分子计算机模型紧密结合的观点[8],本研究以EGFR与基于力达霉素的重组融合蛋白抗体偶联药物相互作用的三维结构为研究对象,利用分子对接、动力学模拟等方法研究EGFR与Fv-LDP-D3-AE、EGFR与Fv-LDP-AE的相互作用模型,模拟二者之间可能结合的部位,旨在为揭示其靶向机制提供理论支撑。

1 计算方法

1.1 分子对接

1.1.1 抗原抗体对接

从PDB数据库中下载EGFR的晶体结构和氨基酸序列(PDB-ID∶1NQL[9]),使用Pymol软件[10]完成EGFR蛋白的预处理。本课题组前期研究获得Fv-LDP-D3-AE、Fv-LDP-AE和LDP-D3-AE的稳定三维结构模型[11]。本研究采用ZDOCK(3.0.3版)软件预测抗原抗体可能的结合方式[12],采用ZDOCKScore[9]对对接结构进行评分排序,选取评分最高的对接结果作为候选模型。

1.1.2 使用PDBePISA和pymol分析两蛋白之间的相互作用

利用PDBePISA网站分析蛋白复合体对接模型中的相互作用面的大小和自由能的高低[13]。利用Pymol软件对蛋白三维结构进行可视化,分析抗原和抗体之间的相互作用,预测相互作用的氨基酸残基。

1.2 分子动力学模拟

采用Gromacs 2024.3[14]分别对Fv-LDP-D3-AE-EGFR、Fv-LDP-AE-EGFR和LDP-D3-AE-EGFR的最优构象进行动力学模拟。每个模拟体系均采用TIP3P水模型[15],置于显性正十二面体水分子模型中,蛋白质采用AMBER99SB力场[16],配体采用GAFF力场[17],其中配体参数由Multiwfn 3.8(dev)[18]与Sobtop 1.0(dev4)[19]生成。向体系添加抗衡离子(Na+和Cl-)保持其电中性,通过最陡下降法和共轭梯度法将系统能量最小化,NVT系综和NPT系综对其两相平衡100 ps,模拟时长100 ns。

1.3 结合自由能计算和能量分解

分别提取EGFR与3种抗体偶联药物的复合物结构稳定后10 ns动力学轨迹的200个构象,采用MM-GBSA[20-22]计算EGFR与Fv-LDP-D3-AE、Fv-LDP-AE及LDP-D3-AE的结合自由能、进行氨基酸残基自由能分解[23]。计算公式如下:

式中,ΔEgas为气相中的内能;ΔGsol为溶剂化自由能,包括非极性溶剂化能ΔGsurf和极性溶剂化能ΔGgb;TΔS为熵效应对结合能的贡献;ΔEvdw为范德华力作用能;ΔEele为静电作用能。

本文主要研究抗原和抗体的结合模式,熵效应对结合自由能的影响可以忽略不计[24,25]。

2 结果与讨论

2.1 分子对接结果分析

EGFR与Fv-LDP-D3-AE排名前十的构象得分为1397.699、1353.186、1260.13、1239.186、1236.598、1234.312、1219.991、1219.528、1204.841、1189.811,取打分最高结果的蛋白对接构象作为分析对象,上传至PDBePISA网站得到蛋白复合体中的相互作用面的大小和自由能的高低。结果显示二者相互作用表面积为1974.3 Å2及ΔiG为-16.4 kcal/mol。EGFR与Fv-LDP-D3-AE相互作用界面如图3所示,相互作用的氨基酸残基如图4所示。三维结构显示靶向EGFR的Fv部分三维结构显示对接到了EGFR的大部分Ⅰ亚区,少部分对接到Ⅲ亚区,此位置与生长因子EGF对接位置有部分重合,在通过内化作用抑制肿瘤增殖的同时可抑制EGFR的二聚化。

EGFR与Fv-LDP-AE排名前十的构象得分1426.245、1321.496、1301.482、1193.22、1189.06、1180.614、1169.575、1168.234、1165.305、1163.71,取其中打分最高结果的蛋白对接构象作为分析对象,分析结果显示二者相互作用表面积为1432.7 Å2

及ΔiG为-8 kcal/mol。EGFR与Fv-LDP-AE蛋白对接可视化结果如图5所示。三维结构显示靶向EGFR的Fv部分三维结构显示对接到了EGFR的Ⅰ亚区。

EGFR与LDP-D3-AE排名前十的构象得分为1272.204、1122.785、1112.316、1083.77、1078.694、1068.434、1060.098、1057.327、1050.261、1045.036,PDBePISA分析结果显示二者相互作用表面积为1072.3 Å2及ΔiG为-1.0 kcal/mol。EGFR与LDP-D3-AE蛋白对接可视化结果如图6所示。三维结构显示LDP-D3-AE的LDP部分作用在EGFR的Ⅰ和Ⅲ亚区,通过多条氢键相互作用。LDP-D3-AE不含有靶向EGFR的部分,与另外两个重组相比结合亲和力较弱。

将分子对接结构综合PDBePISA和Pymol结果分析,重组蛋白Fv-LDP-D3-AE和Fv-LDP-AE与EGFR结合过程中,起到靶向作用的Fv主要结合于EGFR的第Ⅰ结构域。相较于Fv-LDP-AE,重组蛋白Fv-LDP-D3-AE结合能量低,结构稳定,因此D3的存在有助于抗体靶向肿瘤细胞。此外,两个重组蛋白与EGFR结合后均形成了20条左右的氢键,氢键相互作用有助于二者结合。

2.2 动力学模拟结果分析

2.2.1 均方根偏差分析

均方根偏差(RMSD)用于衡量原子在模拟过程中的波动幅度,体现复合物在模拟过程中相对于初始结构的偏差[26]。复合物的蛋白骨架随时间变化的RMSD见图7,图7表明复合物Fv-LDP-D3-AE-EGFR、Fv-LDP-AE-EGFR和LDP-D3-AE-EGFR的RMSD值分别在动力学模拟开始30、25和25 ns后趋于收敛平衡,3个体系均达到稳定状态。

2.2.2 均方根波动分析

均方根波动(RMSF)用于评估残基在模拟时的波动情况,RMSF值越大,残基越灵活;RMSF值相对较小,则残基构象稳定[27]。图8为3种复合物的RMSF,图8a中Fv-LDP-D3-AE残基编号 135～361的区域数值波动小,表明该区域柔性较小,为保守区域;EGFR末端波动大,表明这一区域柔性较强。由图8b可知Fv-LDP-AE残基编号为 135～230和250～350的区域数值波动小,表明这些区域柔性较小,为保守区域;EGFR残基编号305附近和末端数值波动较大,该区域柔性较强。图8c表明LDP-D3-AE残基编号150～270数值波动较小,为保守区域;EGFR末端及残基编号320附近波动数值较大,说明该区域柔性较强。

2.2.3 回旋半径分析

回旋半径(Rg)评估蛋白质在动力学模拟过程中的紧凑性和灵活性,指示蛋白质的稳定性[28]。图9显示3种复合物的Rg随时间的变化,由图9得出Fv-LDP-D3-AE-EGFR的回旋半径在30 ns后趋于稳定,波动范围稳定在4.01 nm,表明其紧密程度高且结构稳定;Fv-LDP-AE-EGFR的整体结构在Rg为3.67 nm的位置附近上下波动,紧密度高且结构稳定;LDP-D3-AE-EGFR的回旋半径在25 ns后趋于稳定,在3.68 nm附近波动,表明其紧密程度高且结构稳定。

2.2.4 非键相互作用分析

图10～12分别展示了动力学模拟之后Fv-LDP-D3-AE、Fv-LDP-AE和LDP-D3-AE与EGFR之间的非键相互作用。由图10可知,Fv-LDP-D3-AE与EGFR结合时主要能量贡献残基集中于Fv-LDP-D3-AE的35～245区域和EGFR的Ⅰ亚区;Fv-LDP-D3-AE中的ASP54和EGFR中的ARG48为结合自由能的重要贡献者,二者形成氢键和盐桥。由图11可知,Fv-LDP-AE与EGFR结合时主要能量贡献残基集中于Fv-LDP-AE的35～161区域和EGFR的Ⅰ亚区;Fv-LDP-AE中的ASP33和EGFR中的ARG125形成了氢键和盐桥,是结合自由能的重要贡献者。由图12可知,LDP-D3-AE与EGFR结合时主要能量贡献残基集中于LDP-D3-AE的2～120区域和EGFR的Ⅰ亚区,少部分集中在EGFR的Ⅲ亚区;LDP-D3-AE中的PHE2和EGFR中的ARG353形成了氢键,是结合自由能的重要贡献者。从相互作用类型来看,氢键与盐桥是促进抗肿瘤蛋白与EGFR抗原特异性结合的重要作用力。

2.3 结合自由能计算结果

通过MM-GBSA计算3种复合物的结合自由能,由表1可知,EGFR与3种抗体偶联药物的结合自由能均为负值,说明对接复合物均会自发形成键合。结合的主要贡献来自于范德华力和静电作用力,小部分来自于非极性溶剂化能,而极性溶剂化能在很大程度上对其结合是不利的。

2.4 单个氨基酸残基的能量分解结果

分别对3种复合物的氨基酸残基进行能量分解,明确抗原抗体结合过程中发挥关键作用的残基,结果如图13～15所示。图中标注的氨基酸残基能量贡献值均超过2 kcal/mol,侧链能量分布与总能量基本保持一致。图13表明Fv-LDP-D3-AE中编号35和54及EGFR中编号20、48、50、101、128、353和359的氨基酸能量主要分布在侧链上,二者结合过程中共有7个残基产生较强的相互作用,包括抗体Fv-LDP-D3-AE的ASP54和GLY245,抗原EGFR的ARG48、ARG353、TYR101、SER99和ASN128。图14表明Fv-LDP-AE中编号56和64及EGFR中编号13、103、104和361的氨基酸能量主要分布在主链上,二者结合时相互作用较强的残基有Fv-LDP-AE的TYR35、ASP33和TYR161,EGFR的LEU14、ARG125和THR15。图15表明LDP-D3-AE中编号49、50、53、100和119及EGFR中编号15、153、353、355、和363氨基酸能量主要分布在主链上,二者结合过程中相互作用较强的残基有LDP-D3-AE的PHE2,EGFR的SER356及PHE156。3种复合物中氨基酸的分布区域与RMSF的分析结果相吻合,说明这些区域是蛋白质的保守区域。

3 结论

对接结果表明Fv-LDP-D3-AE和Fv-LDP-AE通过Fv部分主要结合在EGFR的第Ⅰ亚区,D3有助于提升抗体与靶点的结合紧密程度,从而增强靶向效率。LDP-D3-AE不含Fv,其LDP部分虽也能与EGFR的Ⅰ、Ⅲ亚区结合,但亲和力较弱。充分分析模拟结果,抗体Fv-LDP-D3-AE、Fv-LDP-AE及LDP-D3-AE与抗原EGFR的结合自由能分别为-84.17、-65.94和-51.95 kcal/mol。结果表明EGFR与Fv-LDP-D3-AE和Fv-LDP-AE的结合非常稳定,与LDP-D3-AE结合的稳定性不如另外两种复合物,MM-GBSA分析进一步验证了3种复合物的结合亲和力,发现静电作用力范德华力是促进复合物形成的主要作用力。

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