蛋白质分离纯化材料的研究进展

20世纪90年代初,美国科学家发起了人类基因组计划这一科学项目,整个基因组测序工作在2003年完成[1]。这项工作为疾病和基因活动的研究提供了有力支持,但并不是所有疾病都是由基因突变引起的。由于基因表达的复杂性,同一基因在不同时期、不同条件都可能表现出完全不同的作用。蛋白质作为基因表达的承担者,在细胞和生物体的生命活动中的作用是自发的[2]。因此,后基因组计划由此兴起,重要内容之一便是蛋白质组学研究[3]。

蛋白质作为生命活动的主要执行者,参与了信号传导、代谢调控、免疫应答等关键生物学过程[4],在生物技术、药物开发[5]、临床诊断[6]和食品工业生产等众多领域,高纯度、高活性的蛋白质都是不可或缺的。蛋白质分离纯化就是从复杂的生物体系中分离和富集目标蛋白质,去除杂质(如核酸、多糖等),以便获得满足特定需求的蛋白质产品,进行蛋白质功能结构和应用研究。传统的蛋白质纯化方法,如沉淀法、电泳法[7]、色谱法[8]、固相萃取等,虽然在蛋白质纯化中发挥了重要作用,但随着人们对蛋白质纯度和活性要求的不断提高,以及蛋白质研究的日益深入,这些方法在某些方面逐渐显现出操作复杂、纯化效率低、对蛋白质活性影响较大等局限性。另外,复杂样本中低丰度蛋白质的分离和鉴定仍然是一个难题,需要开发更高灵敏度的分离方法。因此,开发新型的蛋白质纯化材料成为研究热点,如分子印迹材料[9]、微流控芯片、磁分离材料等。新型蛋白质纯化材料具有独特的物理化学性质和生物相容性,能够为蛋白质纯化提供更有效的手段,为生物医学、农业、食品科学等领域提供了更丰富的蛋白质资源。本文将对蛋白质分离纯化材料的研究进展进行综述,介绍传统材料和新型研究成果,并展望未来蛋白质分离领域的发展趋势。

1 用于蛋白质纯化的传统材料与技术

蛋白质分离技术的发展可以追溯到20世纪初。早期的蛋白质分离方法主要包括沉淀、萃取、电泳、透析、层析色谱等,这些方法不断更新进步,在蛋白质研究中发挥了重要作用。

1.1 沉淀法

沉淀法是最早应用于蛋白质纯化的方法之一,基于溶解度差异达到蛋白质分离的效果。通过向蛋白质溶液中加入某些化学物质以降低蛋白质溶解度,使其从中沉淀出来。沉淀法操作简便,成本较低,但分离纯度相对较低,常用于蛋白质的初步分离。根据沉淀原理的不同,沉淀法可分为盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等。

盐析是通过向蛋白质溶液中加入高浓度的盐类(如硫酸铵、氯化钠等),影响蛋白质之间的静电相互作用并介导蛋白质的疏水相互作用,同时可以增强或降低蛋白质[10]溶解度。Li等[11]将盐析萃取与阳离子交换色谱相结合,从牛奶中分离出乳糖过氧化物酶,比传统的纯化技术具有更好的回收率和纯化效率。盐析法操作简便,对蛋白质的活性影响较小,但分离纯度相对较低,常用于蛋白质的初步分离。

有机溶剂沉淀是指在蛋白质溶液中加入乙醇、丙酮等有机溶剂从而使水溶液介电常数降低,进一步导致蛋白质的溶解度降低并析出沉淀。Gallart等[12]利用有机溶剂沉淀法开发了一种便捷、低廉的方法,成功从人血浆中分离细胞外囊泡;与传统方法相比,得到的EVs的大小分布和形态基本一致。Grossmann等[13]借助等体积比的有机混合溶剂(乙醇和丙酮)成功从小球藻中沉淀出所需蛋白质。有机溶剂沉淀法分离速度快,但可能对蛋白质的活性产生一定影响。

蛋白质在等电点时的溶解度最低,等电点沉淀就是通过调节溶液的pH使不同pI的蛋白质沉淀析出分离。Fawole等[14]利用等电沉淀法制备了低纤维、灰、脂、高蛋白和总能量含量高的解毒麻疯树蛋白质分离物。等电点沉淀法分离纯度高,但操作过程较为繁琐,且低pH条件通常会导致产量的严重下降和生物活性的降低。

1.2 萃取法

利用蛋白质在两种不相溶溶剂中的分配差异进行分离的方法称为萃取法。常见的萃取体系包括双水相体系、固相萃取等。双水相萃取法利用聚合物之间或聚合物和盐[15]之间的互不相容性,结合蛋白质在两种水相之间分配系数的差异进行分离提取。Kruse等[16]研究了通过含水双相系统直接从工业相关的中国仓鼠卵巢细胞系的培养液中选择性提取单抗的方法。然而,溶液萃取法分离纯度高,但操作过程相对繁琐,且需要大量有机溶剂,对环境造成一定影响。固相萃取技术(SPE)对于脱盐蛋白质和糖样品非常有用,是相当广泛的提取分离、净化浓缩有机化合物的方法。Zhao等[17]制备了微米大小的Fe3O4@琼脂糖-苯甲脒磁珠(MABB),对胰蛋白酶的最大吸附能力达1 946 mg/g,引入磁性纳米粒子,构建了基于MABB的MSPE策略(图1),成功用于草鱼内脏中胰蛋白酶纯化,保证了纯化后的胰蛋白酶的生物活性。

1.3 电泳法

电泳法利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离。溶液的pH离蛋白质的pI越远,蛋白粒子携带的电荷越多,粒子移动的速度也就越快。电泳法分离度高,适用于蛋白质的精细分离和纯度鉴定。毛细管电泳(CE)是一种以毛细管为分离通道,由高压直流电场[18]驱动的分离技术。根据蛋白质的不同特性们可以对毛细管进行表面修饰或者通过在缓冲液中加入一些物质来改变其分布行为。Zhu等[19]对多种蛋白质混合物的非凝胶筛选CE的分离参数进行了优化,发现筛分培养基材料可以大大提高蛋白质分离的效率。Johansson等[20]利用CE技术从不同奶牛体内分离出纤溶酶和纤溶酶原衍生物,用于对比不同胎次组之间的牛奶质量。

1.4 透析法

透析法利用半透膜的选择透过性,使小分子物质和溶剂通过膜孔,而大分子蛋白质则被截留在膜内,一般与其他分离纯化方法相结合来提高蛋白质纯度,从而实现蛋白质的分离和纯化。Kidambi等[21]合成纳米孔原子薄膜(NATM)并应用于透析。结果证实,小分子模型分子(约200～1 355 Da)和蛋白质(约4 000 Da)的大小选择性分离和脱盐使渗透性增加了约1～2个数量级。Liu等[22]采用简单的两相层状生长法合成了一种具有均匀垂直介孔的二氧化硅膜。该薄膜具有完整的结构和超薄厚度(≤50 nm)。该膜被制成纳米过滤器,性能优异,可以分离和纯化不同尺寸的蛋白质。透析法操作简便,适用于蛋白质的脱盐、除杂和浓缩。

1.5 色谱法

色谱法因其优异的选择性和良好的分离效率,在分离纯化生物大分子的过程中是不可缺少的方法。Boughanmi等[23]研究介绍了一种高效的、利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)提取毒液衍生蛋白质的技术。重点关注梯度洗脱条件和色谱柱的固定相特性,以提高分离的有效性。这使得6种毒液蛋白质的分离得以一步完成。这一突破简化了毒液多肽和蛋白质的纯化,使该过程更加可行和经济,为开发多肽类新药提供了新的思路。离子交换色谱(IEC)基于蛋白质的等电点和系统pH差异实现蛋白质的分离纯化,是一种常见的物理化学方法。Riguero等[24]结合固定化金属亲和层析(IMAC)技术,通过优化填料金属结合载量、色谱实验参数以及蛋白质上的标签残基比率,开发了一个稳定可拓展的程序,采用 250 mmol/L咪唑的洗脱条件成功纯化包含单体4-His和6-His标记的双特异性蛋白。成功分离纯化出在HEK-293和CHO细胞中表达的不同分子量和形式的各种多聚组氨酸标记蛋白质。

2 用于蛋白质纯化的纳米材料

2.1 磁性纳米材料

磁性纳米材料由于其快速分离、超顺磁性和生物相容性等各种能力[25],成为蛋白质组学、药物传递和基因传感领域的讨论课题。这些纳米材料也被称为磁性纳米颗粒(MNPs),具有更大的表面积,在纳米范围内更容易功能化,被认作蛋白质分离和分析方法的极好选择。

四氧化三铁是迄今为止最常见的一种MNPs,能够通过共价、非共价、物理或生物相互作用力与蛋白质形成强键,在分离和纯化蛋白质时增加其功能化合成效率。功能化的MNPs与生物分子等配体结合,可以增加对蛋白质的识别和结合。微生物蛋白质的分析和富集也是可以用MNPs进行的。有研究人员[26]合成磁性纳米颗粒(mag-NPs),并进一步用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对其进行改性,然后将β-内酰胺抗生素阿莫西林共价连接到它们的表面,其可以通过外部磁铁轻松分离细菌。Pan等[27]制备了一种以转铁蛋白(咖啡酸)包覆的分子印迹磁性纳米颗粒(PCA-MIMN),对靶糖蛋白具有良好的结合亲和力和特异性,并将其与pH触发的异色氧化石墨烯(AGO)连接起来,成功地应用于人血清样本中TRF的测定,结果如表1所示。

2.2 碳纳米材料

碳纳米材料包括碳纳米管和石墨烯等,具有较大的比表面积和独特的电学、力学性质。碳纳米管表面可以通过化学修饰引入亲水性基团或特异性识别基团,从而实现对蛋白质的选择性吸附。Yang等[28]在氮掺杂磁性碳纳米管表面沉积聚多巴胺制备印迹材料,对BSA的吸附量可达到150.86 mg/g,成功应用于胎牛血清中BSA的分离和纯化。Yu等[29]将肽取向表面印迹磁性纳米颗粒与碳纳米管基荧光信号输出装置连接起来(图2),用于灵敏检测人表皮生长因子受体2,印迹因子为5.1,表明通用的肽导向表面印迹可以很容易地扩展到其他蛋白质生物标志物的识别与吸附。

石墨烯的机械性能、热稳定性和电学性能使其成为一种特殊的碳基材料,可用于药物传递剂、生物传感器、化疗等各种行业和领域[30]。除此之外,石墨烯及其氧化物的表面被修饰,就可以识别、分离和纯化蛋白质、多肽和磷酸肽。例如,Cheng等[31]将石墨烯表面用二氧化钛进行修饰,设计并构建了一种新型石墨烯复合亲和材料,利用其高纯度和结晶良好的亲和涂层以及独特的多孔结构,实现从复杂生物样品中选择性捕获和快速分离低丰度磷酸肽,为低丰度磷酸肽生物标志物的分离纯化提供研究思路。蛋白质和氨基酸对人类和所有生物都是必不可少的。此外,这些化合物还存在于制药、食品和化妆品行业。Araujo等[32]合成和应用一种基于氧化石墨烯和琼脂的纳米生物复合材料,测试了该复合材料对肌红蛋白的吸附性能。在pH 5和25 ℃的平衡状态下,表现出超过790 mg/g的最大实验吸附容量。由于GO与聚合物琼脂基质相互作用,产生3D材料,可以用于固定床柱以及单元和二元系统中吸附和分离肌红蛋白。

2.3 量子点

量子点(QDs)是一种半导体纳米晶体,具有低毒性、高水溶性、高效的光捕获、优异的光稳定性、显著的荧光特性等优异的光学性能[33],将特异性识别蛋白质的抗体或配体修饰在量子点表面,即可实现对蛋白质的富集。量子点与磁性纳米材料(MNPs)的协同作用为蛋白质分离提供了高灵敏度与快速分离的双重优势。首先,量子点凭借其窄发射光谱、宽激发光谱及可调荧光特性,可实现多色标记与实时监测,尤其适用于低丰度蛋白质的荧光追踪。其次,磁性材料如Fe3O4纳米颗粒,具有超顺磁性,可通过外部磁场实现快速分离,减少离心或过滤步骤对蛋白质活性的影响。除此之外,二者的物理化学性质互补,可通过共价键进行偶联,如通过氨基-羧基反应或点击化学将QDs与MNPs表面修饰的功能基团(如羧基、氨基)连接,形成稳定的复合物(如QDs@MNPs)。例如Vinduska等[34]构建了一种使用量子点结合免疫磁性纳米颗粒捕获和富集检测外泌体表面蛋白质的简便方法。通过ELISA验证,该策略可以特异性检测不同癌症细胞系外泌体上的不同表面标记物,测得HER2阳性乳腺癌症患者的外泌体表现出比健康对照高5倍的HER2表达水平。这种基于量子点的外泌体捕获方法快速,只需要微升稀释的血浆,无需预纯化处理,可用于基础囊泡研究和临床应用的常规使用。

3 用于蛋白质纯化的高分子聚合物材料

3.1 分子印迹聚合物

分子印迹聚合物(MIPs)是由模板分子和功能单体在引发剂的作用下形成的聚合物,具有定制的结合位点,模板分子被洗脱后,在聚合物中形成独特的印迹孔穴,实现特异性捕获。MIPs对目标蛋白质具有高选择性识别能力。在Duan等[35]的研究中,集成了硼酸盐亲和可控定向表面印迹尼龙线(BAC-OSINW)和异色氧化石墨烯(AGO),目标糖蛋白被BAC-OSINW基于分子印迹识别而被特异性捕获,对转铁蛋白的吸附容量为19.81 μg/mg,检测限达0.86 ng/mL,与商业化的ELISA试剂盒对比具有更高的精度和准确度(表2),为糖蛋白相关疾病的早期诊断提供了经济高效且易于使用的方法。Xu等[36]使用一种多肽交联剂AGE14M来合成溶菌酶印迹聚合物,与相应的BIS交联聚合物相比,印迹模板更易去除,印迹效果提高近10倍。目标蛋白其生物活性在很大程度上保持不变。该印迹聚合物通过简单的吸附和洗脱过程,从鸡蛋白中成功分离出高纯度、高活性的溶菌酶,且回收率较高。

但分子印迹聚合物(MIPs)的印迹效率受多重因素影响,需通过实验设计优化以实现高选择性,首先模板分子选择需要模板分子(如溶菌酶、凝血酶)的尺寸与印迹孔穴匹配以及稳定性考量,因为高温或极性溶剂可能引起模板变性,需采用温和聚合条件(如低温光引发)或使用模拟模板(如短肽段)。其次是功能单体与交联剂配比,交联剂(如EGDMA)占比过高会降低孔穴柔性,影响模板洗脱;占比过低则导致结构松散。Turk等[37]构建了一种基于多巴胺层的分子印迹聚合物电化学生物传感器。通过调节交联度(80%～95%),优化了凝血酶印迹传感器的结合动力学,具有较低的检测限(5 pg/mL)以及较宽的线性范围(5～200 pg/mL)。并进一步优化了聚合条件,采用极性溶剂(如水/乙腈混合体系)增强模板与单体的预组装,在临床诊断中具有重要应用。

3.2 功能化聚合物材料

近年来,聚合物因其柔性改性、高表面积、可调结构和稳定的物理化学性能等优良性能而被广泛研究。功能化聚合物是通过在聚合物主链上引入特定功能基团来实现对蛋白质的选择性识别和结合。Zhao等[38]以改性疏水性Fe3O4纳米粒子、苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯为原料,通过两步分散聚合合成了微米级超顺磁性聚合物球体。该聚合物对模型蛋白的吸附量达190.66 mg/g,是非模型蛋白的3.2倍。Li等[39]利用胶体-晶体模板法与硼亲和技术结合,将乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合物、苯乙烯等材料引入二氧化硅微球中,进行苯硼酸修饰,得到具有高比表面积、高孔隙率和硼酸识别位点的聚合物3DOM(图3)。材料对卵清蛋白的最大吸附能力可达到438.79 mg/g,对分离蛋白进行了SDS-PAGE电泳分析,证明其对糖蛋白优异的分离富集性能、良好的选择性、效率和高通量。Pham等[40]采用种子乳液聚合法制备单分散多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯微珠,用硅壳作为水相容性的各种功能硅烷化合物的保护层和表面改性位点。当与流式细胞术或微流控系统一起使用时,单分散磁性聚合物在简单、经济的医学诊断、药物筛选和组合化学合成等方面具有巨大的潜力。

4 用于蛋白质纯化的生物材料

4.1 天然多糖材料

天然多糖,如壳聚糖、琼脂糖、纤维素等,具有良好的生物相容性和可生物降解性。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化得到的多糖,其分子链上含有大量的氨基和羟基。这些官能团可以通过离子交换、氢键等作用与蛋白质结合。Liu等[41]开发了一种由海藻酸盐微球和羧甲基壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶组成的新型药物递送系统。在体外,牛血清白蛋白从复合凝胶中的释放曲线在磷酸盐缓冲盐水中可以持续两周。Mi等[42]合成了负载壳聚糖的高度亲水性二维共价有机框架(NUS-10)。用NUS-10@CS富集后,共检测到辣根过氧化物酶、胰蛋白酶消化物中的34种糖肽,且富集效率很高,有助于更有效地识别潜在的疾病生物标志物,更轻松准确地诊断疾病。

琼脂糖由于其优异的生物相容性和凝胶-溶胶特性得到广泛应用。Li等[43]通过蛋白质模板化策略开发了一种制备具有增强传质稳定性的大孔琼脂糖微球(AG)的新方法。受益于材料表面的大孔结构,复合材料对牛血清白蛋白和牛血红蛋白表现出优异的结合能力。此外,与DEAE-Sepharose Fast Flow相比,在色谱测试中表现出理想的分离效果,突显了它们作为快速分离和纯化蛋白质的有效色谱培养基的潜力。Zhao等[44]基于琼脂糖的热可逆溶胶-凝胶转变性质,提出了一种简单而新颖的制备磁性Fe3O4@Agarose-IDA-Ni微球(MAIN)的策略(图4),对牛血红蛋白的最大吸附能力为1 069.2 mg/g,并成功地利用MAIN从细胞培养基上清液中富集了组氨酸标记的RSV-F0。

纤维素也是一种广泛应用的天然多糖材料。经过化学改性的纤维素,如羧甲基纤维素,具有不同的电荷性质,可以根据蛋白质的等电点差异,通过离子交换作用实现蛋白质的分离。Feng等[45]研究了羧甲基纤维素吸附对大豆分离蛋白(SPI)界面特性的影响及其与乳液稳定性的相关性。与单独使用SPI乳液相比,SPI-CMC乳液表现出较低的Zeta电位和粒径,其独特的结合机制有效地延长了油滴的消化并调节了游离脂肪酸的释放,使其成为设计缓释大豆分离蛋白质营养补充剂的合适模型。Tian等[46]开发了一种简单稳定的方法制备羧甲基纤维素珠(CMCBs),具有大量纳米孔、高度的血液相容性、抗凝活性以及出色的机械强度,可以抵抗血液涌动的冲击。CMCBs具有7.67 mg/g的低密度脂蛋白的吸附能力,用于选择性和有效地清除血液灌流中的 LDL。

4.2 生物分子衍生材料

以生物分子为基础衍生的材料在蛋白质纯化中展现出独特的优势。例如,蛋白质A和G能够特异性地结合免疫球蛋白的Fc段,广泛应用于抗体的纯化。Kim等[47]将蛋白质A附着在氯苯硅烷功能化磁性纳米颗粒上,实现了颗粒表面的控制取向,以增强结合能力。与商业化微粒相比,这些纳米颗粒可以使蛋白质固定化能力增加11.5倍,抗体结合能力增加7倍。经过3个循环步骤后,这些纳米颗粒仍然保留了80%的初始蛋白结合能力。此外,Chen等[48]制备了十二烷烷酸酯-DNA生物偶联物,并将其附着在链霉亲和素包被的磁性纳米颗粒上,合成了新的V12O32-DNA@SVM复合材料。研究表明,0.1 mg该复合物在0.1 mL肌凝蛋白溶液中,吸收肌凝蛋白的效率高达99.4%。

另外,核酸适配体是一种通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的单链寡核苷酸,能够特异性识别目标蛋白质。在Sun等[49]的研究中,采用核酸适配体的pull-down方法分离细胞裂解物中结直肠癌核酸适配体的靶蛋白PPIA。此外,该研究基于核酸适配体Apt-S61开发了一种无标记生物传感器,用于检测PPIA蛋白,检测限为0.008 μg/μL。该核酸适配体靶蛋白的发现和基于核酸适配体的生物传感器的构建为结直肠癌的早期诊断提供了一种新方法。Wen等[50]以寡核苷酸适配子形式为基础,利用其对抗SARS-CoV-2病毒的单个人单克隆抗体可变区的特异性三维印记,作为生物受体应用于石墨烯晶体管传感器中,实现了在几分钟内对匹配抗体的无标记、快速、灵敏检测,研究证明适配体作为捕获试剂在分离、定量复杂生物混合物中单克隆抗体方面的普遍适用性。

5 其他

5.1 微流控技术

微流控芯片将样品采集、分离、富集和检测等功能全部集成到芯片中,实现了生物样品分析和检测的集成、自动化,具有高效、高通量、低成本[51]的特点。微流控芯片体积小,可用于与多个芯片并行实现高通量的蛋白质分离。目前,各种基于电泳或色谱原理分离的芯片已被开发出来。Nielsen等[52]制备了微流体的EOF电泳芯片,通过聚乙二醇二丙烯酸酯修饰芯片表面,减少蛋白质分离中的非特异性吸附,提高生物对早产风险诊断标志物的检测分辨率。Rho等[53]填充阴离子交换粒子填充微通道具有一定的缓冲容量,开发了一种基于色谱聚焦的微流控芯片,可以形成连续的pH梯度,然后根据其pI分离蛋白质。

5.2 反相胶束

表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中,当其浓度超过临界胶束浓度时,在有机溶剂内形成的胶束叫反胶束(Reversed micelle)或称反相胶束。反相胶束(RM)是表面活性剂的纳米级聚集物,其最重要的应用就是蛋白质的分离和纯化。Prabhu等[54]采用改进的镍螯合反胶束体系对人类干扰素γ进行纯化,与现有方法进行比较,提取效率显著提高了72%,反萃效率为91.2%,有效回收率达67.3%,纯度提高约79.5%。另有研究人员[55]使用简单的反胶束萃取技术,利用非离子表面活性基Triton X-100/水/甲苯胶束在低温下提取AMS8脂肪酶,该方法将成为重组冷适应脂肪酶下游加工的重要工具。

5.3 智能响应性材料

温度响应型吸附剂,在不同温度下对蛋白质的吸附和解吸性能差异明显,可用于蛋白质的分离和纯化。Sun等[56]开发了一种使用3种功能化的温度响应色谱固定相的组合分别捕获小鼠血清中的酸性蛋白、碱性蛋白和糖蛋白的方法。将温度响应性聚合物聚(N-异丙烯酰胺)连接到固定相上。对小鼠血清进行分析,成功鉴定出313个蛋白质,比之前方法的鉴定数量多1.46倍。Okubo等[57]开发了基于聚(N-异丙基丙烯酰胺)的温度响应固相萃取系统,成功构建了卵清溶菌酶的高效纯化体系,并进一步拓展至从杂交瘤细胞上清中选择性分离出利妥昔单抗。

pH响应型材料通过在材料表面引入pH敏感的功能基团来实现对蛋白质的可控吸附和解吸。Wang等[58]设计了一系列由2-(二乙氨基)甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸单元组成的pH敏感功能性介孔二氧化硅材料,并通过原子转移自由基聚合合成。在一定pH下,该材料可以从混合溶液中特异性去除特定蛋白质。所提出的方法从蛋清样品中胚清蛋白和溶菌酶的最大去除效率分别为99%和92%,从人血清样品中对人血清白蛋白的最大去除效率约为80%。Taketomi等[59]基于pH敏感性材料首次证实MIL-101(Cr) MOFs对变性蛋白的选择性吸附特性,发现该材料对溶菌酶和碳酸酐酶B的吸附容量较天然状态提高3.2倍,为变性蛋白快速纯化提供了新策略。

6 传统方法与新型材料的性能权衡分析

传统方法如沉淀法和色谱法在蛋白质纯化中具有成熟的应用基础,但其局限性显著。例如,沉淀法成本低廉且操作简单,但选择性和分离效率较低,仅适用于粗提阶段;色谱法虽选择性高,但依赖昂贵填料和复杂设备,难以满足高通量需求。相比之下,新型材料通过功能化设计显著提升了性能:①效率与成本:磁性纳米材料和微流控技术通过快速分离(磁性)或集成化操作(微流控)大幅缩短纯化时间,但纳米材料合成和芯片制备成本较高,集成化芯片可在10 min内完成血浆分离,通量提升5倍,但芯片单价超过200美元。②选择性与特异性:分子印迹聚合物和生物适配体材料通过仿生识别机制实现靶蛋白的高特异性结合,其吸附量可提升10倍,但模板制备和适配体筛选过程复杂,推高了成本。③稳定性与重复性:新型材料稳定耐用、可重复使用。部分智能响应材料(如pH敏感材料)虽多次循环后性能会衰减,但仍比传统材料稳定。阴离子交换介质使用10次后结合容量下降30%～40%,温度响应型固相萃取系统重复使用5次后效率仅下降10%,pH敏感介孔材料在10次循环后吸附容量保持率大于85%。

因此,选择纯化材料需根据具体需求权衡指标:低成本粗提可选沉淀法,高纯度精细分离需色谱法或分子印迹材料,而复杂样本中的快速处理则推荐磁性纳米材料或微流控技术。

7 总结与展望

随着蛋白质纯化技术的不断发展,未来的蛋白纯化材料研究将聚焦于多功能性、智能化、绿色可持续发展以及低成本、简便制备等方向。多功能材料将集成磁性、荧光和亲和性等多种特性,实现蛋白质的高效分离与实时监测,满足生物制药中高纯度药物蛋白生产的需求,并为临床诊断提供精准的疾病检测手段。智能化材料能够根据环境变化自动调节对蛋白质的吸附和解吸,提高纯化效率和质量,有望在自动化蛋白纯化系统中发挥重要作用。同时,开发环境友好型纯化材料和工艺,减少有机溶剂使用,降低废弃物排放,符合绿色可持续发展的要求。此外,深入研究材料与蛋白质之间的相互作用机制,结合计算机模拟和先进表征技术,将有助于设计出更具针对性和高效性的纯化材料。解决材料的稳定性、重复性等问题,推动其在生物制药、临床诊断等领域的广泛应用,也将是未来研究的重点。

综上所述,蛋白质纯化材料的研究为蛋白质纯化技术带来了更多机遇和发展空间。随着材料科学、生物技术等多学科的交叉融合,相信会有更多性能优异、功能独特的新型蛋白质纯化材料涌现,为蛋白质相关领域的发展提供有力支持。

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