基于ST-6-2核酸适配体的显色探针用于快速检测新冠病毒S蛋白

新冠肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染病,自2019年底暴发以来,已对全球公共卫生、经济和社会生活造成深远影响[1,2]。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β属,其表面分布有刺突蛋白(Spike protein,S蛋白)、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白4种结构蛋白。其中,S蛋白以三聚体形式形成“王冠”状结构,介导病毒与宿主细胞受体的结合。具体而言,S蛋白的S1亚基通过受体结合结构域(RBD)识别宿主细胞表面的血管紧张素转换酶II(ACE2),随后S2亚基促进病毒包膜与细胞膜的融合,完成入侵过程[3,4]。因此,S蛋白不仅是病毒感染的关键分子,也是机体免疫应答的主要靶点,其序列变异直接关联病毒的传染性和免疫逃逸能力。快速、准确地检测S蛋白,对于早期诊断、疫情监测及变异株筛查具有重要意义[5-7]。

目前,SARS-CoV-2检测主要依赖实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR),该方法通过扩增病毒ORF1ab、N或E基因片段实现高灵敏检测,是临床确诊的金标准。然而,RT-qPCR需要专业实验室、热循环仪器和训练有素的技术人员,检测时长通常为2～4 h,难以满足基层社区、口岸、家庭等场景下的即时检测需求[2,4]。抗原检测(如胶体金免疫层析法)操作简便、快速(15～20 min),适合大规模筛查,但其灵敏度相对较低,存在窗口期,易出现假阴性。基于CRISPR/Cas系统的检测技术(如DETECTR、SHERLOCK)结合试纸条可实现可视化快速检测,灵敏度较高,但目前仍处于临床验证阶段,且部分体系需要预扩增步骤。病毒分离培养耗时数天,仅适用于科研[2]。因此,开发一种快速、低成本、便携、无需复杂仪器的S蛋白检测新方法,是当前COVID-19防控技术的重要补充方向[8]。

核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从随机文库中筛选获得的单链DNA或RNA分子,能够折叠成特定的二级或三级结构,通过氢键、疏水相互作用、范德华力等与靶标高亲和力、高特异性结合。相较于传统抗体,适配体具有可化学合成,批间差异小,成本低廉;热稳定性好,可反复变复性,便于储存和运输;易于进行巯基、生物素等化学修饰,便于固定和信号标记;靶标范围广,包括小分子、毒素、蛋白质甚至完整细胞等显著优势[9-11]。这些特性使适配体成为生物传感器领域中理想的识别元件[12,13]。针对SARS-CoV-2 S蛋白,Wang等[14]筛选获得了一条名为ST-6-2的适配体,其平衡解离常数(Kd)为80.22 nmol/L,表现出良好的亲和力,为本研究提供了关键识别元件。

金纳米颗粒(AuNPs)具有独特的局域表面等离子体共振(LSPR)特性[8,15]。当AuNPs分散良好时,溶液呈酒红色,在520 nm附近有单一吸收峰,当AuNPs发生聚集或因表面修饰导致局部介电环境改变时,吸收峰红移,溶液颜色变为蓝紫色或紫红色。这种肉眼可辨的颜色变化使得AuNPs成为比色传感器的理想信号标签。通过Au-S共价键将巯基修饰的DNA探针固定在AuNPs表面,可构建稳定的显色探针[8,15,16]。然而,DNA磷酸骨架带负电,与同样带负电的柠檬酸根保护AuNPs之间存在静电排斥,因此需要优化偶联条件[17]。目前常用的偶联策略包括盐老化法、冷冻-解冻法和低pH法,不同方法在偶联效率、稳定性和操作便捷性上各有优劣,系统比较这3种方法对AuNPs-DNA探针制备的指导意义尚不充分[15]。

本文旨在基于ST-6-2适配体,结合AuNPs比色信号放大,构建一种用于快速检测新冠病毒S蛋白的显色探针,并系统比较3种AuNPs-DNA偶联策略,确定最优制备方案。

本检测体系的核心是竞争性侧向流层析原理。显色探针(AuNPs@SH-DNA)由AuNPs表面共价偶联两条DNA链构成。一条是与ST-6-2适配体部分互补的巯基化cDNA(SH-cDNA),另一条是辅助稳定巯基化Poly T(SH-Poly T)。同时,试纸条的检测线(T线)上固定有生物素化的DNA序列(DNA-TL),该序列与ST-6-2适配体另一区域互补。质控线(C线)固定有链霉亲和素(SA),用于捕获生物素标记的对照分子。

当不存在S蛋白时,ST-6-2适配体与显色探针混合后,适配体通过碱基互补配对与cDNA结合,从而被锚定在AuNPs表面。将该混合物滴加至试纸条样品垫,在层析作用下,适配体-显色探针复合物移动至T线,适配体上的另一区域与T线固定的DNA-TL杂交,从而将AuNPs富集在T线,显示红色条带。同时,部分未结合或游离的AuNPs继续泳动至C线,被SA捕获,C线亦显红色。

当存在S蛋白时,ST-6-2适配体优先与S蛋白高亲和力结合,形成适配体-S蛋白复合物。该复合物占据了适配体与cDNA互补的区域,使得适配体无法再与显色探针上的cDNA杂交。因此,AuNPs表面未能携带适配体,当层析至T线时,无法被DNA-TL捕获,T线不显色或显色减弱,而C线由于SA捕获机制不受影响,仍显红色。通过T线红色信号的有无或强度,即可定性或半定量判断S蛋白的存在,如图1所示。

该策略实现了“有靶标→T线信号消失”的竞争型检测模式,可有效避免假阳性,并可通过调节适配体与cDNA的比例来调控检测灵敏度。

本研究中,首先采用圆二色光谱验证ST-6-2适配体与S蛋白的结合构象变化。其次,通过柠檬酸钠还原氯金酸法制备粒径均一的AuNPs,并优化浓缩条件。然后,比较冷冻-解冻法、盐老化法和低pH法3种偶联策略,筛选出最佳方案制备显色探针。最后,组装侧向流试纸条,对S蛋白进行检测,初步评估传感器的响应性能。该比色传感器平台为新冠病毒S蛋白的快速、低成本、可视化检测提供了新的技术方案,有望应用于基层筛查和即时检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UV2600型紫外分光光度计(日本高新技术有限公司);Super Mini Dancer型调速型迷你离心机(生工生物工程(上海)股份有限公司);ST2100型pH计(奥豪斯仪器(常州)有限公司);TLE204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);EQ-100DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);W31型多头磁力加热搅拌器(国华(常州)仪器制造有限公司);JEOL-2100F型透射电子显微镜(日本JEOL公司);J-815型圆二色光谱仪(日本分光株式会社)。

四氯金酸(HAuCl4,分析纯,上海皓鸿生物医药科技有限公司);蔗糖(C12H22O11)、柠檬酸三钠(C6H5O7Na3)(分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);氯化钠(NaCl,分析纯,天津市北联精细化学品开发有限公司);牛血清白蛋白(分析纯,上海麦克林生化科技有限公司);三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,C9H15O6·HCl,分析纯,北京华中海威基因科技有限公司);浓盐酸(HCl,分析纯,成都市科隆化学品有限公司);4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES,C8H18N2O4S,分析纯,武汉普诺赛生命科技有限公司);辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(分析纯,北京博尔西科技有限公司)。所用试剂均为分析纯。

SARS-CoV-2刺突蛋白适配体ST-6-2序列(5′-GGGGAGGGCGGGTGGATTGGATGCCGA-3′)源于Yang等[3]研究,表观解离常数为80.22 nmol/L。本实验使用的引物由Sangon公司合成并纯化,具体序列如表1所示。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA探针的制备

圆二色光谱(CD)可以应用于核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的分析,通过测量分子左右圆偏振光之间的吸收差异,揭示分子构象的细微变化和二级结构特征,为深入了解核酸适配体与目标分子的作用机制提供理论依据[12]。分别在新冠病毒S蛋白冻干粉和适配体ST-6-2储备液中加入超纯水,使其溶解,配制成500 ng/mL的S蛋白溶液和10 μmol/L适配体溶液,并将两种溶液混合反应30 min。

分别取适配体ST-6-2和混合溶液加入比色皿中,在相同条件下用圆二色光谱仪(扫描范围200～400 nm,扫描速率100 nm/min,光程1 mm)进行扫描,每个样品平行测定3次。

1.2.2 显色探针(AuNPs@SH-DNA)的制备

1.2.2.1 AuNPs的合成

AuNPs的合成采用柠檬酸钠还原氯金酸法(Frens法)。准确称取0.10 g氯金酸(HAuCl4),溶于100 mL超纯水中,配制成质量浓度为0.1%的储备溶液,转移至棕色试剂瓶中,避光冷藏保存。另称取1.00g柠檬酸三钠,溶于100 mL超纯水中,配制成质量浓度为1.0%的溶液备用。

取5 mL上述配制的HAuCl4储备液,用超纯水稀释10倍,得到0.01%的工作溶液,并在500 r/min搅拌下加热至90 ℃,快速一次性加入5 mL上述配制柠檬酸钠(1.0%)溶液,快速搅拌下继续加热反应10 min。当溶液颜色变为酒红色后,停止加热,搅拌速度调至300 r/min,冷却至室温,获得胶体金溶液,置于4 ℃备用。

1.2.2.2 AuNPs与DNA探针的偶联

AuNPs与巯基化DNAs之间通过Au-S共价键链接,由于磷酸骨架结构带负电荷,所以DNA引物与AuNPs结合困难。因此,AuNPs表面修饰SH-DNA的关键一步是缩短DNA与AuNPs的间距[5,18]。本文通过3种方法将AuNPs与DNA探针进行偶联。

Jing等[19]提出了DNA功能化AuNPs的新方法,即在超局部反应体积中发生化学共价反应交联,采用冰冻的方法减小反应的空间,从而增大反应物的浓度。结冰是一种物理现象,当气温下降时,水分子会慢慢凝结成冰晶,AuNPs、DNA和盐分等会被迁移到“微囊”内,导致加速DNA的附着,提高AuNPs与DNA的结合力。

具体实验方法为在离心管中分别加入50 μL(5 μmol/L)的SH-cDNA与SH-Poly T、20 μL(5 mmol/L)的TCEP,活化30 min,加入1000 μL AuNPs溶液(1.2.2.1中制备),置于-20 ℃环境冷冻14 h后于室温下解冻。

盐老化法核心是将结构稳定且带负电荷的柠檬酸根离子引到AuNPs表面,为了减弱与AuNPs的电荷排斥,加入盐溶液[15]。将高浓度的盐溶液加入到AuNPs和DNA的混合体系中,降低其扩散层的厚度,削弱AuNPs和DNA之间的排斥力,以此实现AuNPs与DNA探针偶联成功[17]。

准确称取0.2338 g的NaCl固体,用超纯水配制成0.2 mol/L溶液,微孔滤膜过滤,备用。在离心管中分别加入50 μL(5 μmol/L)的SH-cDNA与SH-Poly T、20 μL(5 mmol/L)的TCEP,孵育 30 min,加入1000 μL AuNPs,静置24 h后每隔 2 h向溶液中加入适量0.2 mol/L的NaCl溶液,加入3次,最终使体系中NaCl浓度为50 mmol/L。

有研究发现降低溶液的pH值可以显著加快DNA吸附速度。利用腺嘌呤(pKa=3.5)在柠檬酸钠(pH 3.0)中生成质子,降低DNA负电性,实现AuNPs与SH-DNA的快速偶联[20]。低pH(高浓度H+)和盐在DNA附着过程中具有协同作用,只将pH调整到3.0,而不加入其它的盐,DNA会在初始时被吸附于AuNPs,但进一步的吸附会受阻,加入盐,则加快进一步的吸附。500 mmol/L柠檬酸钠-盐酸缓冲液含有1500 mmol/L Na+。因此,当pH 3.0时H+与Na+产生协同作用。此外,部分柠檬酸根离子也发生质子化,降低AuNPs与DNA间的电荷斥力,有利于DNA的快速附着[15]。

准确称取14.7050 g的柠檬酸三钠固体,用超纯水配制成500 mmol/L的溶液,并用盐酸制成pH 3的500mmol/L的柠檬酸钠-盐酸缓冲液,微孔滤膜过滤,备用。在离心管中分别加入50 μL(5 μmol/L)的SH-cDNA与SH-Poly T、20 μL(5 mmol/L)的TCEP,活化30 min,加入1000 μL AuNPs(1.2.2.1中制备),孵育10 min,加入适量柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液,使其浓度为10 mmol/L,孵育3 min,用1 mol/L HEPES(pH 7.6)将体系pH调至中性。

1.2.3 试纸条的组装

常规的试纸条的制造流程包括多个步骤,涉及喷膜、干燥、组装、切条等工艺,对设备要求较高。本文选购了为正生物抗原抗体试剂盒,通过改装用于新冠病毒S病毒的检测,改装后,干燥避光备用。

1.2.4 检测刺突蛋白

量取3 μL(100 μmol/L)biotin-DNATL和3 μL (2mg/mL)链霉亲和素(SA)储存液,加入60 μL PBS缓冲液,稀释10倍,室温孵育1 h,制得检测线(T线)溶液。称取2.0 g蔗糖、1.0 g牛血清白蛋白(BSA)及500 μL Tween-80,配制成运行缓冲液。将S蛋白储备液用超纯水稀释,保证最终浓度为13 μg/mL。将S蛋白储备液用超纯水稀释至终浓度13 μg/mL,与ST-6-2适配体混合活化30 min,得到样品液。随后,在探针垫上加入5 μL AuNPs@SH-DNA,并在硝酸纤维素膜(NC膜)上涂布适量T线溶液,烘干备用。最后,将样品液与运行缓冲液混合,滴加至样品垫,观察显色情况。

2 结果与讨论

2.1 DNA探针表征

圆二色谱测量结果如图2所示,ST-6-2适配体在262 nm处呈现正峰,在241 nm处呈现负峰。与S蛋白结合后,ST-6-2的正峰和负峰强度均减小。其中,正负峰减小表明右/左旋光性均减弱,该变化归因于适配体与靶标蛋白之间的产生相互作用[5]。

2.2 AuNPs的表征

2.2.1 不同浓度HAuCl4对AuNPs的影响

紫外可见光谱测定结果如图3所示,所制备AuNPs的最大吸收波长约为520 nm处,是纳米金颗粒的特征吸收峰。而且HAuCl4的浓度直接影响AuNPs的制备效率,0.1% 的HAuCl4储备液稀释8倍时产物效果优于稀释10倍的产物,如图3所示。

2.2.2 浓缩时间对AuNPs的影响

较高浓度的AuNPs才能够有效与DNA偶联。离心浓缩法虽然可以增加AuNPs的浓度,但是,导致AuNPs发生严重团聚,无法满足后期与DNA的偶联,如图4a所示。本文采用蒸发浓缩方法,以蒸发时间(5～40 min)对其浓缩时间进行研究。如图4b所示,蒸发30 min时,获得的AuNPs效果最佳。

2.2.3 AuNPs的TEM及合成过程的颜色变化

透射电镜实验结果显示,所制得的AuNPs为粒径大小约30 nm左右的均匀分散颗粒,而且明显观察到d=0.23 nm的晶格,如图5a,图5b所示。所制得的AuNPs溶液呈现酒红色,并显示出很好的透明度。向8倍稀释的0.1% HAuCl4溶液中加入0.1%柠檬酸钠溶液后溶液颜色由无色变为酒红色,并且随着加热时间延长颜色变深,如图5c所示。这种颜色变化可能与局域表面等离子体共振(LSRP)有关。当AuNPs被入射光激发时,自由电子远离平衡位置的相干振荡,AuNPs可以吸收或散射一定波长的光线,从而使溶液呈现酒红色[8]。

2.3 AuNPs@SH-DNA的表征

2.3.1 AuNPs@SH-DNA的UV-Vis及颜色

AuNPs的UV-Vis全波段扫描结果显示,游离的AuNPs在522 nm处观察到表面等离子体共振的特征性吸收峰。DNA探针与AuNPs的偶联使其最大吸收波长红移8 nm,AuNPs@SH-DNA最大吸收峰在530 nm处,如图6a所示。这种红移是由于AuNPs表面功能化引起的折射率增加所导致[10]。AuNPs与DNA探针偶联,使其颜色由酒红色变为紫红色,如图6b所示,这可能与特征吸收峰红移有关。

2.3.2 不同偶联法制AuNPs@SH-DNA的UV-Vis

在冷冻-解冻法制备AuNPs@SH-DNA中,考察体系中加入TCEP和AuNPs溶液的量及冷冻时长等3个因素对AuNPs与DNA探针的偶联效果影响。发现TCEP的加入使紫外最大吸收波长发生红移,当加入量为20 μL(5 mmol/L)时,最大吸收波长达到530 nm左右,说明AuNPs与DNA偶联形成AuNPs@SH-DNA。继续增加TCEP的量(30、40、50 μL),则吸收强度减弱,如图7a所示。单纯改变AuNPs的加入量(500、1000 μL)未能改变最大吸收波长发生红移,证明AuNPs与DNA无法偶联成AuNPs@SH-DNA,如图7b所示。冷冻时间对偶联影响显著,冷冻14 h后的紫外最大吸收波长红移8 nm,表明AuNPs与DNA探针偶联成功,如图7c所示。冷冻时间长或者短于14 h,均不利于偶联制备AuNPs@SH-DNA。

用盐老化法偶联制备AuNPs@SH-DNA时,加入不同量的NaCl溶液,均未能使AuNPs的紫外最大吸收波长从522 nm红移至530 nm,所以此法未成功将AuNPs与DNA探针进行偶联,如图7d所示。而在低pH法偶联时,加入柠檬酸钠-盐酸缓冲液可以将最大吸收波长红移至532 nm左右,说明偶联成功,如图7e所示。

2.4 S蛋白检测的试纸

实验结果显示,T线试纸显红色,C线试纸无明显变化,设计的Apt-LFTS具有良好的灵敏度,能够实现高效的定性分析和定量检测,满足对S蛋白浓度的精确测定需求。

3 结论

本研究成功构建了一种基于ST-6-2核酸适配体与AuNPs的比色生物传感器,用于快速检测新冠病毒S蛋白。通过圆二色光谱验证了适配体与S蛋白结合后构象发生变化,为传感器的识别机制提供了理论依据。采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备了粒径均匀的AuNPs,并优化了其浓缩条件,提高了偶联效率。系统比较了冷冻-解冻法、盐老化法和低pH法3种DNA-AuNPs偶联策略,结果表明低pH法偶联效果最佳,可使最大吸收波长红移8～10 nm,溶液颜色由酒红色变为紫红色。基于竞争性侧向流层析原理组装了检测试纸条,实现了对S蛋白的可视化定性检测。该传感器具有操作简便、响应快速、成本低廉、无需复杂仪器等优点,符合即时检测的需求,在新冠病毒大规模筛查和基层分散式诊断中具有良好的应用前景。后续工作可进一步优化检测灵敏度,建立定量或半定量分析方法,并评估其在真实样本中的检测性能。

[1]Koc H C,Xiao J,Liu W W,Li Y,Chen G K．Int．J．Biol．Sci．,2022,18(12):4768-4780．

[2]Li Y,Long F,Han S T,Wang Y,Zhu A N．Microchim．Acta,2025,192(4):256．

[3]Yang F Y,Feng Y N,Chen C．Chin．J．Virol．,2025,(3):889-900．杨馥荧,冯晔囡,陈操．病毒学报,2025,(3):889-900．

[4]Svobodova M,Skouridou V,Jauset-rubio M,Viéitez I,Fern width=8,height=11,dpi=110

ndez-villar A,Cabrera A J J,Poveda E,Bofill C B,Sans T,Bashammakh A,Alyoubi A O,O′sullivan C K．ACS Omega,2021,6(51):35657-35666．

[5]Wang J C．Development of Aptamer-Based Test Strips for Rapid Detection of SARS-COV-2 S Protein and Research of Uncertainty Evaluation．Beijing:Beijing University of Chemical Technology,2024．王佳晨．快速检测新冠病毒S蛋白的适配体试纸条开发与不确定度评估研究．北京:北京化工大学,2024．

[6]Yang G,Zhang S N,Wang Y C,Li L,Li Y,Yuan D Y,Luo F T,Zhao J C,Song X,Zhao Y Y．Signal Transduct．Target．Ther．,2022,7(1):120．

[7]Shrikrishna N S,Halder S,Kesarwani V,Nagamani K,Gandhi S．Chem．Eng．J．,2024,493:152841．

[8]Smith-jeffcoat S E,Mellis A M,Grijalva C G,Talbot H K,Schmitz J,Lutrick K,Ellingson K D,Stockwell M S,Mclaren S H,Nguyen H Q．MMWR,2024,DOI:10．15585/mmwr．mm7316a2．

[9]Dinnes J,Deeks J,Berhane S,Taylor M,Adriano A,Davenport C,Dittrich S,Emperador D,Takwoingi Y,Cunningham J．Cochrane db．Syst．Rev．,2021,DOI:10．1002/14651858．CD013705．pub2．

[10]Chen X R,Ding L,Huang X L,Xiong Y H．Theranostics,2022,12(2):574-602．

[11]Röthlisberger P,Hollenstein M．Adv．Drug Deliv．Rev．,2018,134:3-21．

[12]Feng J L,Wu Y Y,Shen Q．Food Anal．Methods,2022,15(8):2202-2212．

[13]Wei X J,Ma P F,Imran M K,Zhang Y,Wang Z P．Talanta,2023,253:124003．

[14]Wang C,Zhu K X,Shi P F,Ding X L,Zhang S S．Chem．Commun．,2022,58(30):4779-4782．

[15]Chen L,Yang G,Qu F．Talanta,2024,276:126246．

[16]Chen A L,Yang S M．Biosens．Bioelectron．,2015,71:230-242．

[17]Zhang J L．Study on the Comparison of Strategy and Mechanism of DNA Functionalized Gold Nanoparticles．Guilin:Guangxi Normal University,2022．张锦玲．DNA功能化修饰金纳米粒子策略比较及作用机制研究．桂林:广西师范大学,2022．

[18]Xu R R,Cheng Y Q,Qi X X,Li X T,Zhang Z W,Chen L Y,Sun T,Gao Z H,Zhu M J．Anal．Chim．Acta,2022,1230:340377．

[19]Jing X X,Zhang Y Y,Li M,Zuo X L,Fan C H,Zheng J H．Mater．Horiz．,2023,10(4):1185-1209．

[20]Jin R Y,Fan Y B,Ruan Y J,Long X,Guo H,Tang Y P．Chin．J．Chem．Educ．,2021,42(22):93-97．靳如意,范燚宝,阮玉俊,龙旭,郭惠,唐于平．化学教育,2021,42(22):93-97．

[21]Lee J,Huh J H,Kim K,Lee S．Adv．Funct．Mater．,2018,28(15):1707309．

[22]Zhang X,Servos M R,Liu J W．J．Am．Chem．Soc．,2012,134(17):7266-7269．