金丹附延颗粒挥发油包合工艺研究

金丹附延颗粒是临床治疗慢性盆腔炎治疗常用中药复方制剂,由牡丹皮、金银花等十三味饮片科学配伍而成[1],该处方中莪术、桂枝、没药、当归、香附等饮片富含挥发性成分,通过水蒸气蒸馏收集挥发油后,加入十三味饮片提取的浸膏中,混合制成金丹附延颗粒。然而,此类挥发油存在气味刺鼻、稳定性差等固有缺陷,含挥发油制剂储存、运输及后续使用过程中易发生迁移与挥发损失[2],不仅影响制剂的用药顺应性,更直接导致药效物质流失,进而削弱临床治疗效果,成为制约该制剂质量提升与产业化发展的核心瓶颈。

β-环糊精包合技术的应用为解决挥发性成分上述问题提供了有效途径。其中β-环糊精包合技术通过分子识别作用,使挥发油成分嵌入β-环糊精的疏水空腔内形成固态包合物粉末[3],可显著改善挥发油的物理化学稳定性,有效掩盖其刺鼻气味,且便于制剂加工与储存运输[4,5]。

桂皮醛作为该复方挥发油中的核心活性成分[6],具有明确的抗炎、抗菌药理作用[7,8],其含量直接关联制剂疗效,因此可作为包合工艺优化的关键评价指标。课题组前期已针对金丹附延颗粒的非挥发性成分开展了系统研究[9,10],但关于其挥发性成分的包合工艺优化及稳定性调控研究尚未见报道,相关技术空白亟待填补。

目前挥发油包合物的制备方法包括饱和水溶液法、超声法、喷雾法等[11-14]。其中饱和水溶液法因操作简便、成本可控、适用于工业化生产等优势,成为中药制剂生产中首选的包合工艺。基于此,本研究拟开展金丹附延颗粒挥发油包合工艺的系统优化研究。通过筛选关键工艺参数,建立稳定高效的包合技术体系,旨在减少包合过程中挥发油的损耗,降低试剂与药品用量,缩短制备周期,进而降低生产成本,为提升金丹附延颗粒的质量稳定性、保证临床疗效提供技术支撑,同时为中药复方挥发油的合理利用与制剂工艺优化提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

DF-101S型恒温旋转搅拌器(上海锦赋实验仪器设备有限公司);LC-20AD型岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司);UV-26OOi型紫外光谱仪(日本岛津仪器(苏州)有限公司);BSA124S-CW型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);EYELA A-1000S型真空抽滤泵(日本东京理化器械株式会社);GFL-230型烘箱(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司);FEl Quanta250型扫描电子显微镜(美国FEI公司);Thermo Scientific Nicolet iS20型傅里叶变换红外光谱仪(美国热电公司)。

挥发油(江西华太药业有限公司);β-环糊精(批号:C17024120,纯度98%,上海麦克林生化科技股份有限公司);桂皮醛对照品(批号:110710-202424,纯度99.8%,中国食品药品检定研究院);乙腈(色谱纯,批号:WXBF6627V,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司);水为超纯水,其余试剂为分析纯。

1.2 包合物的制备

采用饱和水溶液法,将6 g β-环糊精的饱和水溶液(20倍量水稀释)置于50 ℃的旋转搅拌器上,缓慢滴加2 mL(V(挥发油)∶V(无水乙醇)=1∶1)挥发油乙醇溶液,转速800 r/min,反应1 h。反应完成后放入4 ℃冰箱冷藏24 h。取出包合物溶液抽滤,用10 mL纯化水洗涤包合物,再用 20 mL石油醚分次洗涤(每次约3 mL)。包合物连带滤纸放入45 ℃烘箱干燥4 h,取出称重,计算得率:

得率=[包合物的质量/(β-环糊精的质量+加入的挥发油的质量)]×100%

1.3 物理混合物的制备

取3 g β-环糊精置研钵中,加0.5 mL挥发油,研磨使其混合均匀,备用。

1.4 桂皮醛含量测定

色谱柱:资生堂TYPE MG Ⅲ(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:V(乙腈)∶V(水)=35∶65,流速:1 mL/min;检测波长:290 nm;柱温:30 ℃。

1.4.2 对照品溶液的制备

精密称取34.60 mg桂皮醛对照品,置20 mL容量瓶中,加80%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀作为桂皮醛对照品贮备液。精密量取1 mL桂皮醛对照品贮备液,置10 mL容量瓶中,加80%乙醇稀释至刻度,摇匀即得桂皮醛对照品溶液。

1.4.3 包合物供试品溶液的制备

精密称取0.1 g包合物,置25 mL容量瓶中,加20 mL 80%乙醇,超声1.5 h,放冷,80%乙醇补足重,过0.22 μm微孔滤膜,取续滤液,摇匀即得。

1.4.4 挥发油供试品溶液的制备

精密吸取0.2 mL挥发油乙醇溶液,置10 mL容量瓶中,加80%乙醇稀释至刻度,摇匀即得。

精密吸取对照品溶液、包合物供试品溶液及挥发油供试品溶液各1 μL,按1.4.1色谱条件进样分析,结果如图1、2所示。

1.4.6 线性关系考察

分别精密吸取0.3 mL对照品贮备液置于 20 mL容量瓶,加入80%乙醇溶液稀释至刻度后,摇匀;取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL置于2 mL容量瓶中加入80%乙醇溶液稀释至刻度线,摇匀按照1.4.1色谱条件进样分析以对照品质量浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)进行回归。

1.4.7 精密度试验

取供试品溶液,按1.4.1色谱条件连续进样6次,记录峰面积。

1.4.8 稳定性试验

取供试品溶液,于1、2、6、12、24 h时以1.4.1色谱条件进样测定,记录峰面积。

1.4.9 重复性试验

取同一样品,按1.4.3方法制备供试品溶液6份,以1.4.1色谱条件进样测定,记录峰面积,计算含量及相对标准偏差(RSD)值。

1.4.10 加样回收率试验

精密称取6份已知桂皮醛含量的0.1 g包合物,按1.4.3方法制备供试品溶液,加入桂皮醛对照品溶液适量,注入高效液相色谱仪,按1.4.1色谱条件进样测定,记录峰面积,计算加样回收率。

1.5 包合率与载药量的计算

采用HPLC法测定包合物及挥发油中的桂皮醛含量,计算包合率和载药量:

载药量=(包合物中桂皮醛的质量/

1.6 评分标准

参考文献[15,16],选取3个指标,根据重要程度赋予其权重。

2 结果与讨论

2.1 桂皮醛方法学考察

线性关系考察:桂皮醛线性关系方程为y=10050.1463x-2548.3130(R2=0.9975),浓度范围2.5846～25.8462 μg/mL。

精密度试验:桂皮醛峰面积相对标准偏差(RSD)值为0.37%,结果<2.0%,结果表明仪器精密度良好。

稳定性试验:桂皮醛峰面积的RSD值为0.64%,结果表明供试品稳定性良好。

重复性试验:桂皮醛成分含量RSD值为1.34%,结果表明供试品制备方法稳定,重现性良好。

加样回收率试验:桂皮醛成分平均加样回收率为104.19%,RSD为2.00%,符合加样回收率实验要求。

2.2 单因素实验

2.2.1 包合温度的考察

按照1.2的包合物制备方法,其他条件不变,温度分别为30、50、70 ℃进行实验。结果如图3所示,随着温度的增加,包合率逐渐下降。虽然50 ℃时的得率较高于30 ℃时的得率,但总评分在温度升高呈现下降趋势,30 ℃时最高,因此选择30 ℃作为后续实验温度。

2.2.2 包合转速的考察

按照1.2的包合物制备方法,其他因素不变,转速分别为800、1000、1200 r/min进行实验。结果如图4所示,不同转速包合率差异不大,然而转速1200 r/min的得率明显更高,总评分1200 r/min时最高,因此选择转速1200 r/min为中心点做后续实验。

2.2.3 包合时间的考察

按照1.2的包合物制备方法,其他因素不变,时间分别为1、2、3 h进行实验。结果如图5所示,2 h的包合率更高,得率虽低于3 h,但2 h总评分最高,因此选择时间2 h为中心点做后续实验。

2.2.4 β-环糊精与挥发油质量体积比的考察

按照1.2的包合物制备方法,其他因素不变,β-环糊精与挥发油质量体积比分别为6∶1、8∶1、10∶1进行实验。结果如图6所示,比为6∶1和8∶1的包合率相差不大,但比为6∶1的得率明显更高,且比为6∶1的总评分最高。因此选择β-环糊精与挥发油质量体积比为6∶1为中心点做后续实验。

2.3 响应面优化实验

将单因素实验结果确定的实验条件作为优化实验中心点。以时间(A)、转速(B)、温度(C)、β-环糊精与挥发油质量体积比(D)为考察因素,各因素设定三水平,采用四因素三水平进行优化实验,考察各因素对综合评分的影响。因素水平和响应面优化实验结果见表1、表2。

2.4 模型拟合和方差分析

运用Design-Expert 13软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合分析,结果见表3,回归模型F=34.74,P<0.0001,表明该方程和实际情况拟合良好;决定系数R2=0.9720,调整决定系数R2=0.9440,两者差值在0.2内;失拟项检验F=5.87,P=0.0514>0.05,表明失拟项不显著,说明该模型和方程可用来分析工艺优化实验结果和预测最佳工艺条件。时间、转速、温度、β-环糊精与挥发油质量体积比与综合评分的二元一次回归方程Y=72.18+0.6013XA+1.41XB-2.17XC-0.2935XD-0.0145XAXB+0.3646XAXC-0.2466XAXD-0.1957XBXC+0.8853XBXD+0.3196XCXD-0.6094XA2-1.14XB2-1.76XC2-2.82XD2(R2=0.9720)。从单因素对实验结果的影响来看,不同水平的时间、转速、温度均对总评分存在显著性影响,(P均<0.005),且转速、温度的影响效应强于时间。从双因素交互作用的影响来看:交互项BD即转速和包材量的P<0.05,二者的交互影响较为显著;其余的交互影响均不显著。此外,4类因素的二次项P值均<0.05,都对总评分存在显著性影响。根据P值分析4类因素及其交互作用对总评分的影响,绘制三维响应面和二维等高线图。结果见图7,三维响应面图曲线弯曲程度越大,表明对应的交互影响作用越强。二维等高线形状越接近椭圆形,其交互影响作用越明显。三维响应面图中:BD(β-环糊精与挥发油质量体积比-转速)的响应面坡度大、等高线图也呈椭圆形,进一步验证β-环糊精与挥发油质量体积比与转速之间有显著的交互影响效应。

2.5 验证实验

根据软件拟合的最优包合工艺和实际操作条件,确定最优工艺条件为:温度30 ℃、转速1400 r/min、时间2.15 h、β-环糊精与挥发油质量体积比6∶1。按照最优工艺条件进行4次平行实验。结果见表4、5,包合率平均值89.85%,得率平均值92.08%,载药量平均值12.16%,总评分平均值74.76。4项评分值的RSD均在3%以下,说明该工艺平行性良好。

2.6 扫描电子显微镜

用取样工具分别取少量物理混合物、β-环糊精、包合物样品,将其均匀洒在有导电胶带的样品盘上,轻晃样品盘使其分散均匀。处理后的样品置于离子溅射仪进行喷金操作,随后在扫描电子显微镜(SME)下观测样品的颗粒形状和表面特征。观测时电压为20 kV,并采集图像。结果如图8所示:β-环糊精呈现单一的不规则柱状晶体形态。物理混合物由挥发油和环糊精物理混合制备而成,因挥发油对β-环糊精粘连作用,因此该混合物颗粒粒径不均,且颗粒外部表面附着有大量细小晶体。包合物则呈现扁状四方晶体形态,颗粒形态和粒径均保持一致。挥发油进入β-环糊精空腔后形成包合物,改变其晶体原来的排列和分子间作用力,导致与原来的β-环糊精形状存在显著差异。

2.7 薄层色谱分析

分别取10 mg挥发油、1 g β-环糊精、1 g包合物置于100 mL容量瓶中,加80%乙醇溶解。另取各1 g包合物、挥发油β-环糊精物理混合物,置100 mL量瓶中,加80 mL石油醚振摇提取5 min后,加石油醚稀释置刻度,摇匀。取5 μL上述5种溶液,分别点于同一块硅胶G薄层板上,以 V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶17为展开剂展开。展开完成后吹风机冷风吹干,喷上2,4-二硝基苯肼乙醇试液,日光下检视。结果见图9,挥发油、物理混合物以及乙醇溶解的包合物溶液在G薄层板上呈现相同颜色的斑点;而β-环糊精、用石油醚溶解的包合物溶液未出现任何斑点。基于上述结果可得出以下结论:80%乙醇可将包合物中的被包合的成分溶解出来,而石油醚无法溶解出包合物内成分。β-环糊精对包合物质无干扰影响。包合物释放的被包合物质与挥发油、物理混合物在薄层G板上的斑点一致,表明包合过程中目标成分未发生改变。石油醚溶解的物理混合物与挥发油、80%乙醇溶解的包合物斑点一致,说明物理混合物中的挥发油并未进入β-环糊精内部,只是以简单的混合形式附着在β-环糊精外部。

2.8 紫外分析

分别称取10 g挥发油、1 g β-环糊精、1 g包合物分别置于100 mL的容量瓶中,加80%乙醇适量超声溶解完全后,放冷,加80%乙醇稀释至刻度,即得供试品溶液。以80%乙醇溶液为空白溶剂,在800～190 nm波长范围全波长扫描。结果见图10,β-环糊精溶液在800～190 nm检测波长范围无紫外吸收,可排除其对挥发油和包合物紫外检测的干扰;包合物与挥发油均出现紫外吸收特征且挥发油紫外强于包合物,说明包合物内部含有挥发油成分,包合反应完成,非简单的物理混合。

2.9 红外光谱分析

分别称取约10 mg挥发油、包合物、物理混合物、β-环糊精,与200 mg干燥的KBr粉末混合在玛瑙研钵中充分研磨后,取适量放入压片机制成薄片,放入红外光谱仪中检测。400～4000 cm-1波数范围内进行红外光谱扫描,每个样品平行扫描32次。结果见图11,从红外光谱图中可以看出,3380 cm-1附近的宽峰是—OH伸缩振动吸收峰,2930 cm-1附近是C—H的伸缩振动吸收峰,1678 cm-1处是C

O的伸缩振动吸收峰,1432 cm-1处是—CH2的弯曲振动吸收峰,1150 cm-1处是C—O的伸缩振动吸收峰。990 cm-1处是C—H的弯曲振动吸收峰。根据FT-IR光谱对比分析,包合物、β-环糊精、物理混合物及挥发油样品在特征官能团吸收峰上的显著差异,从分子层面证实了包合物的形成。在3380 cm-1附近(O—H伸缩振动),包合物样品的峰相较于环糊精有增强的趋势,表明油分子被包合进入环糊精空腔后,主体分子间的氢键网络被重组或增强。在1678 cm-1处(C

O伸缩振动),挥发油样品中C

O峰在包合物中显著减弱,这是由于C

O基团被包合在环糊精的疏水空腔内,其振动受到屏蔽和微环境改变所致,而混合物仅显示环糊精与油峰位的叠加,无较为显著变化。此外,2930 cm-1(C—H伸缩振动)和990 cm-1(C—H弯曲振动)吸收峰在包合物中的强度降低,表明包合作用对烷基链C—H键振动的限制效应。

3 结论

单因素实验显著性检验结果表明,包合温度、搅拌时间对挥发油包合物的包合率、得率、载药量及综合评分均具有极显著影响(P<0.005);β-环糊精与挥发油的质量体积比对包合率、得率及综合评分影响极显著,对载药量无显著统计学影响;搅拌转速对包合率、综合评分影响显著,对得率与载药量无显著影响。基于上述结果,说明4类因素可作为实验影响因素,将包合温度、搅拌时间、β-环糊精与挥发油配比、搅拌转速4个因素加入后续响应面优化实验,以综合评分为评价指标,考察各因素间的交互作用,筛选最优包合工艺参数。

研究选取包合率、得率、载药量3个核心指标构建综合评价体系:其中包合率反映挥发油的包合效率与原料利用率,直接关联药效物质的保留程度;得率反映包合物的最终成品收率,决定工艺的工业化生产适配性与成本控制;载药量反映单位包合物中药效成分的载药量,直接影响后续制剂的处方设计、成型性与临床给药剂量的准确性。参考文献以及各自指标重要程度,设计包合率占比60%,得率、载药量占比均为20%。

根据响应面实验结果可知,温度对包合率有显著影响:温度升高,包合率明显降低;转速对得率有显著影响:转速越高,得率明显增大。推测其中原因是过高温度会导致挥发油挥发为气态,无法与环糊精有效结合;较高转速可促进挥发油与环糊精的结合,提高得率。然而转速过高也会使部分粒径小的包合物被打成泡沫状,泡沫状在抽滤过程中被洗涤液滤掉,导致包合物的质量减小。因此,搅拌的转速并非越高越好,需要结合水量综合考虑。

但实验还存在不足之处,优化的挥发油包合工艺仅为实验室小试结果,后续需开展中试放大,验证其工业化生产的适配性与稳定性。优化了挥发油包合物生产中的温度、转速、时间和环糊精-挥发油质量体积比影响因素,与原生产条件比,有效地降低了生产成本,符合预期目的。为了更深入做系统性综合评价,选取3种评分指标。本研究采用单因素实验和响应面实验的综合分析,确定了最佳的包合工艺条件,通过平行性试验验证了方法的可靠性,可为后续相关生产的研究和开发提供参考。

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