猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种传染病，俗称“猪蓝耳病”［1-2］。该病以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要临床特征，给中国养猪业带来了巨大的经济损失［3-6］。PRRSV具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、持续性感染和抗体依赖性增强等特性，临床上又常与其他病原体混合感染，致病机制仍不清楚，至今仍无确实有效的防控措施［7-10］。PRRSV是动脉炎病毒属中的一种有囊膜单股正链RNA病毒，长度约为15 kb，基因组包括 至 少10个 开 放 阅 读 框（open reading frame，ORF），其中，ORF1a和ORF1b占总基因组的75%，编码2个多蛋白pp1a和pp1b［11］。这2个多蛋白被自身蛋白水解裂解产生16种非结构蛋白（nonstructural proteins，NSPs），包 括NSP1α、NSP1β 和NSP2相关蛋白（NSP2N、NSP2TF和NSP2）等，其余的ORFs编码 8个结构蛋白，在PRRSV复制中发挥各自功能［12-14］。

PRRSV NSP1α 蛋白包含3个不同的结构域，分别为N端的锌指结构域、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶结构域 （papain-like cysteine protease domain，PCPα）和C-末端延伸区域，在病毒的复制与转录过程中发挥着重要的作用［15］。利用反向遗传技术将PCPα 区域突变失活后发现，PRRSV亚基因组mRNA的合成被完全阻断，但是病毒基因组的复制并没有受到影响，表明NSP1α 蛋白在PRRSV复制中发挥重要作用［16］。除此之外，NSP1α 蛋白具有干扰素（interferon，IFN）拮抗剂的功能。有研究发现，NSP1α 蛋白影响干扰素调节因子3的磷酸化和核定位，进而降解CBP蛋白，达到抑制IFN-β 合成的目的；NSP1α 蛋白还可以通过抑制IκB磷酸化阻断核因子κB活化［17-19］。但是，现阶段针对NSP1α蛋白结构及生物学特性仍不是很清楚，其阻断抗病毒IFN相关通路的分子机制也有待进一步深入研究。具有良好反应活性、高特异性的抗体是研究病毒蛋白功能的基本工具。目前，商品化NSP1α蛋白抗体还没有得到推广应用。本研究以高致病性PRRSV SD16毒 株 为 模 板，扩增NSP1α 基 因 序列，构建pET-28a-NSP1α-His重组质粒，转化入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞，诱导、表达、纯化获得高纯度具有活性的NSP1α 蛋白，进而免疫小鼠制备多克隆抗体，从而为深入研究NSP1α蛋白功能提供了物质基础，并为PRRSV防控靶点的选择提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要载体与细胞

pCAGGS-NSP1α-HA质粒、pET-28a-His原核表达载体、HEK293T细胞、Marc-145细胞均由河南农业大学国家动物免疫学国际联合研究中心实验室保存。

1.2 主要试剂与实验动物

PrimeSTAR® MAX DNA Polymerase、T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I、Trans2K® Plus Ⅱ DNA Marker均购自赛默飞世尔科技有限公司；感受态细胞Trans5α、大肠杆菌BL21（DE3）购自上海唯地生物技术有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、吐温-20购自北京索莱宝科技有限公司；Ni-NTA购自天地人和生物科技有限公司；卡那霉素、DAPI、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Merck Sigma；蛋白质Marker购自北京兰博利德商贸有限公司；anti-His tag Antibody购自北京索莱宝生物科技有限公司；HRP-Goat anti-mouse IgG（H+L）购自苏州睿瀛生物技术 有限公 司；Alexa Fluor 488®-conjugated goat anti-mouse IgG（H+L）购自Abcam；凝胶提取试剂盒和质粒小量提取试剂盒均购自北京全式金生物工程有限公司；TMB化学发光显色试剂盒均购自北京百奥曼科技有限公司。SPF级雌性BALB/c小鼠购自郑州大学实验动物中心。试验按照河南农业大学动物福利与研究伦理委员会批准的试验实践和标准进行（编号：HNND2023031604）。

1.3 试验方法

1.3.1 PRRSV NSP1α蛋白生物信息学分析方法 对PRRSV NSP1α 蛋白的生物学特性进行分析。使用ExPASy-ProtParam在 线 软 件（https：//web.expasy.org/protparam/）分析NSP1α 蛋白的理化特性；Deep-TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测NSP1α 蛋白跨膜区；SignalP 5.0 Server软 件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）在线预测NSP1α 蛋白信 号 肽 序 列；NetPhos 3.1 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）预测 结 果NSP1α 蛋白上丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）可能的磷酸化修饰；NPS@：SOPMA在线软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=/NPSA/npsa_sopma_f.html）预 测NSP1α 蛋 白二级结构；SWISS-MODEL在线软件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测NSP1α 蛋白三级结构。

通过DNAStar Megalign软件分析不同PRRSV毒株间NSP1α 基因同源性。本研究参考的不同PRRSV毒 株 如 下：SD16（JX087437.1）、JXA1（EF112445.1）、HLJ （HQ843178.1）、SX（HQ843181.1）、JL （JX177644.1）、GD（KX815407.1）、HeB （KX815411.1）、HeN（KX815413.1）、HuN （KX815416.1）、LN（KX815423.1）、SC （KX815426.1）、ZJ（KX815433.1）、Ⅱ型PRRSV经 典 毒 株VR2332（EF536003.1）和 I型 PRRSV Lelystad毒 株（NC_043487.1）。括号内为GenBank ID。鉴于PRRSV SD16毒株为高致病性毒株，且河南农业大学国家动物免疫学国际联合研究中心实验室保存有病毒原液，因此选择该毒株的NSP1α 基因进行深入研究。

1.3.2 pET-28a-NSP1α-His重组原核表达载体的构建 根据PRRSV SD16毒株NSP1α 基因在NCBI上的基因序列设计引物，引物序列NSP1α-F：5′-CCGGAATTCATGTCTGGGATACTTGATCGGTGC-3′（下 划线处为酶切位 点EcoR I）；NSP1α-R：5′-CCGCTCGAGTTACTGCGGGAGCGGCAAGTTGGTTAAC-3′（下划线处为酶切位点Xho I）；引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。以PRRSV SD16毒株为模板进行PCR，扩增目的基因。扩增体系：pCAGGS-NSP1α-HA质粒1 μL，上、下游引物各0.5 μL，PrimeSTAR® MAX DNA Polymerase 25 μL，ddH2O补至总体积50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸5 min，共计30个循环。对扩增产物进行质量分数1.0%琼脂凝胶电泳后回收目的基因。将扩增出的目的基因与pET-28a-His分别使用EcoR I和Xho I 37 ℃双酶切2 h，琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因与载体。T4 DNA连接酶将NSP1α 基因与pET-28a-His酶切后回收的基因片段置于连接仪中，16 ℃连接过夜。将连接产物转化入感受态细胞Trans5α，涂布卡那霉素抗性固体LB平板，37 ℃温箱过夜培养。挑取单克隆菌落，进行菌液PCR鉴定。取阳性克隆菌液扩大培养后提取质粒，送北京擎科生物科技股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为pET-28a-NSP1α-His。

1.3.3 pET-28a-NSP1α-His重 组 蛋 白 的 诱 导 表达 将测序正确的pET-28a-NSP1α-His重组质粒转化入表达感受态细胞大肠杆菌E.coli BL21（DE3），涂布平板，使用卡那霉素抗性固体LB培养基37 ℃温箱过夜培养。挑取单克隆菌落，扩大培养。按照1∶100的比例将菌液接入新的卡那霉素抗性液体LB中，37 ℃ 220 r·min-1摇床（ZQLY-180N，上海知楚仪器有限公司）培养菌液至对数期OD600值0.4～0.8，加入终浓度为1 mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），37 ℃ 220 r·min-1摇床培养8 h；收集菌液，使用PBS重悬菌体，超声裂解菌体，功率200 W，工作5 s间歇5 s，工作时间20 min。离心机（5810R，德国Eppendorf公司）4 ℃、10 000 r·min-1离心20 min，分别收集上清液与沉淀，制备蛋白样品。SDS-PAGE仪（EPS300，上海天能生命科学有限公司）分析NSP1α 重组蛋白的表达情况。

1.3.4 NSP1α-His重组蛋白的纯化 NSP1α-His重组蛋白主要以包涵体形式存在，将上述离心后的沉淀使用8 mol·L-1尿素溶解，离心收集上清液，0.45 μm滤器过滤进行镍柱纯化。首先使用5倍柱体积PBS平衡镍柱，加入处理好的NSP1α-His重组蛋白样品，重复上样2次，然后使用含有不同浓度（10、20、30、50、100 mmol·L-1）咪唑的PBS洗涤杂蛋白与目的蛋白，最后通过SDS-PAGE分析NSP1α-His重组蛋白的纯化情况。

1.3.5 NSP1α-His重组蛋白的透析复性 参考吴书雅等［20］的方法，使用尿素浓度梯度对NSP1α-His蛋白进行透析复性，纯化获得的蛋白放入含6 mol·L-1尿素 Buffer A（1 L，NaCl 8.5 g、Tris 12.1 g、精 氨 酸84.3 g、还原型谷胱甘肽1.530 6 g、氧化型谷胱甘肽0.306 4 g和4 mL 0.5 mol EDTA），依次降低尿素浓度至4.0、2.0、1.0、0.5 mol·L-1，最后透析至PBS溶液。SDS-PAGE与Western blot分析蛋白活性。

1.3.6 NSP1α-His重组蛋白多克隆抗体的制备购买5只6周龄雌性BALB/c小鼠饲养7 d，尾尖采血，分离上清液作为免疫前阴性对照。复性后的NSP1α-His重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化，对小鼠进行腹腔注射免疫，每只小鼠免疫重组蛋白25 μg，免疫4只小鼠，另外1只为阴性对照；免疫14 d后用弗氏不完全佐剂乳化重组蛋白免疫小鼠，免疫程序与免疫剂量同首次免疫；每隔14 d免疫1次，共免疫4次。第4次免疫后5 d于小鼠尾尖采血，检测抗体效价。

间接ELISA检测抗体效价具体步骤：NSP1α-His蛋白作为包被抗原，以4 g·L-1每孔100 μL包被至96孔酶标板，4 ℃过夜；PBS’T洗涤3次，每孔加200 μL质量分数2.5%脱脂奶粉，37 ℃封闭2 h；PBS’T洗涤3次，加入不同稀释倍数的小鼠血清（1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000、512 000、1 024 000），37 ℃孵育1 h；PBS’T再 次 洗 涤3次，加 入HRP-Goat anti-mouse IgG（H+L），1∶5 000稀释，37 ℃孵育1 h；最后每孔加入100 μL TMB显色液，25 ℃避光显色10 min，每孔 加 入50 μL 3 mol·L-1 H2SO4终 止 反 应；酶 标 仪（NanoDropTM 8000，美国赛默飞世尔科技公司）读取样品450 nm处吸光度值。当抗原抗体反应450 nm处吸光度值大于等于0.5时，此时稀释倍数为血清抗体的最大稀释倍数。血清抗体效价是指抗体在血清中与抗原结合的能力，以1∶最大稀释倍数来表示。

1.3.7 Western blot检测蛋白表达 生长状态良好的HEK293T细胞铺于6孔板置于细胞培养箱培养16～24 h，汇 合 度 达 到60%～80%。2 μg·孔-1 pCAGGS-NSP1α-HA真核表达质粒转染HEK293T细胞，转染后24 h，胰酶消化收集细胞。生长状态良好的Marc-145细胞铺于6孔板置于细胞培养箱培养16～24 h，汇合度达到60%～80%。感染复数（multiplicity of infection，MOI）值 为0.1的PRRSV感染细胞，感染后24 h收集细胞。NP40裂解细胞，离心收集上清液，加入适量5×Loading Buffer煮沸10 min。每孔上样10 μL进行SDS-PAGE，跑胶结束后，转膜，200 V 50 min。将膜放置于质量分数5%脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜，PBS’T洗膜3次。孵育一抗：自制NSP1α 蛋白多克隆抗体用质量分数5%脱脂奶粉稀释2 000倍，anti-α-tubulin用质量分数5%脱脂奶粉1∶5 000稀释，37 ℃孵育1 h；PBS’T洗膜3次。孵育二抗：HRP-Goat anti-mouse IgG（H+L）用质量分数5%脱脂奶粉1∶5 000稀释，37 ℃孵育1 h；PBS’T再次洗膜3遍，ECL化学发光液显色。

1.3.8 IFA检测多抗 与PRRSV NSP1α 蛋 白 反 应活性 生长状态良好的HEK293T细胞铺于24孔板置于细胞培养箱培养24 h，汇合度达到60%～70%。2 μg·孔-1 pCAGGS-NSP1α-HA真核表达质粒转染HEK293T细胞，转染后24 h，预冷的质量分数70%乙醇固定细胞。生长状态良好的Marc-145细胞铺于24孔板置于细胞培养箱培养24 h，汇合度达到60%～70%。MOI值为0.1的PRRSV感染细胞，感染后24 h固定细胞。质量分数1% BSA 4 ℃封闭过夜，PBS洗板3次。孵育一抗：自制NSP1α蛋白多克隆抗体用PBS 1∶300稀释，37 ℃孵育1 h；PBS洗板3次。孵育二抗：Alexa Fluor 488®-conjugated goat anti-mouse IgG（H+L）用PBS 1∶500稀释，25 ℃避光孵育 1 h；DAPI染核，25 ℃孵育5 min；最后在荧光显微镜（CKX53，日本奥林巴斯株式会社）下观察结果并拍照。

1.3.9 NSP1α 蛋白亚细胞定位分析方法 生长状态良好的Marc-145细胞铺于6孔板置于细胞培养箱培养16～24 h，汇合度达到60%～80%。MOI值为0.1的PRRSV感染细胞，感染后24、36、48 h分别收集细胞，提取胞质和胞核样品，Western blot分析NSP1α 蛋白亚细胞定位。

24孔板内Marc-145细胞在PRRSV感染后24 h，固定、透化细胞样品；质量分数1% BSA 4 ℃封闭过夜，PBS洗3次；孵育一抗：自制NSP1α 蛋白多克隆抗体用PBS 1∶3 00稀释，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次；孵育二抗：Alexa Fluor 594®-conjugated-goat anti-mouse IgG（H+L）用PBS 1∶5 00稀释，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，DAPI染核，荧光显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 PRRSV NSP1α 生物信息学分析结果

2.1.1 PRRSV NSP1α 基因序列同源性分析结果测序结果显示，PRRSV SD16毒株的NSP1α 基因全长为501 bp，其核苷酸序列中A、T、C、G碱基数量分别为98、123、147、133个，占碱基总数的比例分别为19.56%、24.55%、29.34%、26.55%。A+T比例为44.11%，G+C比例为55.89%。SD16毒株的NSP1α 基因与其他PRRSV毒株（JXA1、HLJ、SX、JL、GD、HeB、HeN、HuN、LN、SC、ZJ、Ⅱ型PRRSV经典毒株VR2332和I型PRRSV Lelystad毒株）同源性分析结果显示，其NSP1α 基因与HLJ毒株序列同源性最高，为99.2%；与I型PRRSV Lelystad毒株序列同源性最低，为64.9%；与LN和HeN毒株序列同源性也比较低，分别为87.0%和87.2% （图1）。

图1 不同PRRSV毒株NSP1α 基因序列同源性分析
Fig.1 Homology analysis of NSP1α gene sequence of different PRRSV strains

2.1.2 PRRSV NSP1α 蛋白理化特性分析结果NSP1α 蛋白由166个氨基酸组成，相对分子质量为18 286.42，等电点为9.11。氨基酸组成：丙氨酸Ala（A）13个、精氨酸Arg（R）12个、天冬酰胺Asn（N）6个、天冬氨酸Asp（D）2个、半胱氨酸Cys（C）7个、谷氨酰胺Gln（Q）7个、谷氨酸Glu（E）7个、甘氨酸Gly（G）12个、组氨酸His（H）2个、异亮氨酸Ile（I）5个、亮氨酸Leu（L）20个、赖氨酸Lys（K）3个、甲硫氨酸Met（M）3个、苯丙氨酸Phe（F）6个、脯氨酸Pro（P）17个、丝氨酸Ser（S）8个、苏氨酸Thr（T）11个、色氨酸Trp（W）3个、酪氨酸Tyr（Y）6个、缬氨酸Val（V）16个。NSP1α 蛋白带负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）9个，带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为15个。NSP1α 蛋 白 分 子 式 为C827H1303N225O223S10，原子总数为2 588，消光系数为25 815。预测NSP1α 蛋白半衰期在哺乳动物中为30 h，在酵母中大于20 h，在大肠杆菌中大于10 h。NSP1α 蛋白不稳定指数59.9，大于阈值40，脂肪族氨基酸指数为94.52，亲水性总平均值为0.141。这表明该蛋白为不稳定的疏水性蛋白（图2）。

图2 PRRSV的NSP1α 氨基酸亲-疏水性分析
Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of the PRRSV NSP1 α amino acids

2.1.3 PRRSV NSP1α 蛋 白 特 性 分 析 结 果 用SignalP 5.0 Server软件在线预测显示，NSP1α 蛋白无信号肽序列（图3-A）。DeepTMHMM预测结果显示，NSP1α 蛋白无跨膜结构域（图3-B）。Net-Phos 3.1 server预测结果显示，NSP1α 蛋白上可能存在6个丝 氨 酸（Ser）磷酸 化 位点，6个 苏 氨 酸（Thr）磷酸化位点，1个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点（图3-C）。

图3 PRRSV NSP1α 蛋白特性分析
Fig.3 Analysis of PRRSV NSP1α protein characteristics

A：PRRSV NSP1α 蛋白信号肽序列预测；B：PRRSV NSP1α 蛋白跨膜结构域预测；C：PRRSV NSP1α 蛋白磷酸化位点预测。
A：Prediction of PRRSV NSP1α protein signal peptide sequence；B：Prediction of PRRSV NSP1α protein transmembrane domain；C：Prediction of PRRSV NSP1α protein phosphorylation sites.

对NSP1α 蛋白的高级结构预测结果显示，NSP1α 蛋白的二级结构主要包含α-螺旋（Hh），比例为25.90%；延伸链（Ee），比例为15.06%；无规则卷曲（Cc），比例为59.04%（图4-A）。在此基础上，进一步利用SWISS-MODEL在线软件预测了NSP1α蛋白的三级结构。结果显示，NSP1α 蛋白中含有α-螺旋及较多的无规则卷曲结构（图4-B）。

图4 PRRSV NSP1α 蛋白二级、三级结构预测
Fig.4 Prediction of PRRSV NSP1α protein secondary and tertiary structures

A：PRRSV NSP1α 蛋白二级结构预测；B：PRRSV NSP1α 蛋白三级结构预测。
A：Prediction of PRRSV NSP1α protein secondary structures；B：Prediction of PRRSV NSP1α protein tertiary structures.

2.2 PRRSV NSP1α 基因原核表达、纯化及鉴定

2.2.1 pET-28a-NSP1α-His重组载体的构建结果如图5-A所示，在540 bp附近出现一条明显条带且与预期大小基本一致。pET-28a-His原核表达载体与PCR产物分别使用EcoR I和Xho I进行双酶切，随后经连接、转化、菌液PCR鉴定及测序，最终成功构建pET-28a-NSP1α-His重组载体，如图5-B—C所示。

图5 pET-28a-NSP1α-His原核表达载体的构建
Fig.5 Construction of pET-28a-NSP1α-His prokaryotic expression vector

A：PCR 扩增NSP1α 基因。M：DNA 相对分子质量标准 DL 5 000；1：阴性对照；2：NSP1α 基因；B：pET-28a-His 原核表达载体与NSP1α 基因双酶切。M：DNA 相对分子质量标准DL8 000；1：pET-28a-His 载体未酶切对照；2：pET-28a-His 载体双酶切；3：NSP1α 基因双酶切；C：菌液PCR 鉴定。1～10：10 个单菌落；11：阴性对照。
A：PCR amplification of the NSP1α gene.M：DNA marker DL 5 000；1：Negative control；2：NSP1α gene；B：Double-restriction of pET-28a-His and NSP1α gene.M：DNA marker DL8 000；1：Without enzyme digestion；2：Double-restriction of pET-28a-His；3：Double-restriction of NSP1α gene；C：Identification of the recombinant plasmid pET-28a-NSP1α-His by PCR.1-10：10 single colonies；11：Negative control.

2.2.2 pET-28a-NSP1α-His重组原核表达质粒的诱导表达与纯化 SDS-PAGE分析发现，与未诱导相比，IPTG诱导后在20 kD附近出现明显条带，与预期大小相一致，超声破碎后发现NSP1α-His重组蛋白主要以包涵体形式存在，如图6-A所示。镍柱纯化、蛋白复性最终获得较高纯度的NSP1α-His重组蛋白，如图6-B所示。

图6 PRRSV NSP1α-His重组蛋白的表达与纯化
Fig.6 Expression and purification of PRRSV NSP1α-His recombinant protein

A：SDS-PAGE 分析PRRSV NSP1α 重组蛋白的表达。M：蛋白Marker；1：未诱导；2：IPTG 诱导后；3：超声后沉淀；4：超声后上清液；B：SDS-PAGE 分析NSP1α 重组蛋白的纯化。1：10 mmol·L-1 咪唑；2：20 mmol·L-1 咪唑；3：30 mmol·L-1 咪唑；4：50 mmol·L-1 咪唑；5：100 mmol·L-1咪唑；6：透析复性后NSP1α 重组蛋白。
A：SDS-PAGE analysis of the recombinant PRRSV NSP1α protein expression.M：Protein Marker；1：pET-28a vector control；2：Induction with IPTG；3：Inclusion body in precipitation after sonication；4：Soluble protein in supernatant after sonication；B：SDS-PAGE analysis of the purified NSP1α protein.1：10 mmol·L-1 imidazole；2：20 mmol·L-1 imidazole；3：30 mmol·L-1 imidazole；4：50 mmol·L-1 imidazole；5：100 mmol·L-1 imidazole；6：Renaturated NSP1α protein.

2.2.3 PRRSV NSP1α-His重 组 蛋 白 的Western blot鉴定 如图7所示，在20 kD附近出现1条单一条带，这表明NSP1α-His重组蛋白成功表达。

图7 PRRSV NSP1α-His重组蛋白Western blot鉴定
Fig.7 Western blot identification of PRRSV NSP1α-His recombinant protein

M：蛋白Marker；1：IPTG 诱导后pET-28a-NSP1α-His 重组载体；2：纯化复性后NSP1α-His 重组蛋白。
M：Molecular weight markers；1：pET-28a-NSP1α- His recombinant vector induction with IPTG；2：Renaturated NSP1α-His protein.

2.3 PRRSV NSP1α 蛋白多克隆抗体制备及反应活性鉴定

2.3.1 鼠源NSP1α 蛋白多克隆抗体效价测定以纯化复性后获得的NSP1α-His重组蛋白作为包被抗原，与不同稀释倍数的小鼠多抗血清反应。间接ELISA结果显示，经过4次免疫后小鼠血清样品稀释倍数达64 000，即抗体效价达到1∶64 000，可以用于后续试验，如图8所示。

图8 NSP1α 蛋白多克隆抗体效价间接ELISA检测结果
Fig.8 Indirect ELISA analysis of titers of polyclonal antibodies against NSP1α protein

2.3.2 真核表达NSP1α-HA重组蛋白的多克隆抗体识别 为了分析制备的NSP1α-His重组蛋白多克隆抗体是否可以特异性识别真核表达的NSP1α 蛋白，pCAGGS-NSP1α-HA真核表达载体转染HEK293T细胞，转染后24 h，细胞被收集或固定用于Western blot和IFA检 测。Western blot检测 结 果 显示，在预测大小20 kD附近出现1条单一条带，IFA结果与Western blot结果一致，与对照组相比，试验组观察到特异性荧光，如图9所示。上述结果表明制备的多克隆抗体可以特异性结合真核表达的NSP1α-HA重组蛋白。

图9 制备的多抗识别真核表达的NSP1α-HA重组蛋白检测结果
Fig.9 Identification of polyclonal antibody recognition of NSP1α-HA protein

A：Western blot 检测真核表达NSP1α-HA 重组蛋白；B：IFA 检测真核表达NSP1α-HA 重组蛋白。比例尺100 μm。
A：Western blot identification of NSP1α-HA recombinant protein；B：IFA identification of NSP1α-HA recombinant protein.Scale bar 100 μm.

2.3.3 PRRSV NSP1α 蛋白的多克隆抗体识别如图10-A所示，在20 kD附近出现单一条带并与预期大小相符，IFA也检测出特异性荧光。如图10-B所示，NSP1α 蛋白主要分布于细胞核内。综上所述，制备的NSP1α 多克隆抗体可以用于PRRSV NSP1α 蛋白的Western blot和IFA检测。

图10 制备的多抗与PRRSV NSP1α 蛋白反应活性鉴定
Fig.10 The reactivity of the prepared polyclonal antibody against PRRSV NSP1α protein

A：Western blot鉴定制备的多抗与PRRSV NSP1α 蛋白反应活性；B：IFA 鉴定制备的多抗与PRRSV NSP1α 蛋白反应活性。比例尺100 μm。
A：Western blot identification of the reactivity of the polyclonal antibody with PRRSV NSP1α protein；B：IFA identification of the reactivity of the polyclonal antibody with PRRSV NSP1α protein.Scale bar 100 μm.

2.4 PRRSV NSP1α 蛋白亚细胞定位分析结果

通过Western blot和激光共聚焦检测NSP1α蛋白亚细胞分布。Western blot检测结果表明，在PRRSV感染后不同时间点，NSP1α 蛋白均分布于细胞核内，如图11-A所示。激光共聚焦结果也显示，NSP1α 蛋白主要定位在细胞核内，如图11-B所示，与Western blot检测结果一致。上述结果表明，PRRSV感染期间，NSP1α蛋白主要定位于细胞核内。

图11 PRRSV NSP1α 蛋白亚细胞定位鉴定
Fig.11 The subcellular location of PRRSV NSP1α rotein

A：Western blot鉴定PRRSV NSP1α蛋白亚细胞分布；B：激光共聚焦鉴定PRRSV NSP1α蛋白亚细胞分布。比例尺100 μm。
A：Western blot identification of the subcellular location of PRRSV NSP1α protein；B：Confocal identification of the subcellular location of PRRSV NSP1α protein.Scale bar 100 μm.

3 结论与讨论

PRRSV具有本身高变异、持续性感染、抗体依赖性增强、免疫逃逸等特性，导致自2006年高致病性PRRS在中国暴发以来，至今仍无确实有效的防控策略［21-24］。目前，PRRS仍是影响中国养猪业的主要疫病。NSP1α 是PRRSV的一个非结构蛋白，其抑制IFN-I产生及促进PRRSV复制的分子机制仍不清楚［25］。探索NSP1α 蛋白在病毒逃逸中的功能需要利用NSP1α 蛋白特异性抗体，但目前没有针对NSP1α 商品化抗体。本研究成功获得高纯度且具有良好抗原活性的NSP1α 蛋白。纯化复性后的蛋白免疫小鼠，制备针对NSP1α 蛋白的多克隆抗体。Western blot和IFA结果显示制备的多克隆抗体可以特异性识别天然的NSP1α 蛋白，且特异性强，这为深入研究NSP1α 蛋白功能奠定了基础。

PRRSV NSP1α 蛋白的结构和功能仍需不断探索。本研究利用生物信息学软件对其蛋白结构、功能进行详细分析。结果显示，不同Ⅱ型PRRSV毒株间NSP1α 基因的同源性比较高，均超过80%，但其与I型PRRSV的NSP1α 基因序列同源性只有64.9%，相对较低，表明其是Ⅱ型PRRSV中相对保守的一种病毒非结构蛋白。预测结果显示，NSP1α蛋白没有信号肽序列，表明其不是一种可分泌到细胞外的病毒蛋白。无规则卷曲是蛋白质中具有明确而稳定的结构，但不能被归入明确的二级结构的区域，是蛋白质发挥功能和形成特定构象的重要区域［26］。本研究发现，NSP1α 蛋白结构中，无规则卷曲比例达到59.04%，表明其在维持NSP1α木瓜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶裂解活性中可能发挥关键作用。本研究还发现，NSP1α 蛋白上不同位点可能存在磷酸化修饰，但是这些修饰是否真实存在及其对PRRSV复制及致病性影响尚不清楚。但有研究表明，一些PRRSV蛋白，如核衣壳蛋白（N）、NSP2的磷酸化修饰对病毒复制及毒力至关重要［27-28］。因此，NSP1α 蛋白上磷酸化修饰的生物学意义还有待深入研究。

制备抗体的关键是抗原。外源蛋白表达系统主要包括原核表达系统、真核表达系统、酵母表达系统，其中，原核表达系统具有操作简单、表达量高、制备成本低等优点，是最常用的蛋白表达系统。本试验中NSP1α 蛋白以包涵体形式存在。包涵体致使蛋白无法正确折叠和形成空间构象，影响其功能。因此，为了获得具有良好生物学活性的NSP1α蛋白，参考已报道的复性液［20］，进行透析复性。Western blot结果显示，本研究最终获得高纯度且具有良好反应活性的PRRSV NSP1α 蛋白。纯化复性后的蛋白免疫小鼠，第4轮免疫后采集血液检测抗体效价可达1∶64 000，表明NSP1α 蛋白具有良好免疫原性，可用于特异性抗体的制备和鉴定。利用制备的多克隆抗体分析PRRSV感染过程中NSP1α 蛋白亚细胞定位，发现几乎所有的NSP1α 蛋白均定位于细胞核内。之前有报道表明，PRRSV NSP1α 蛋白部分分布于细胞核内［17］，这与本研究结果不一致，推测是PRRSV感染后不同时期，NSP1α 蛋白在胞质、胞核内分布不均一导致。本研究为NSP1α 蛋白功能深入研究提供了物质基础。

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Prokaryotic expression and preparation of polyclonal antibodies against PRRSV NSP1α protein

ZHANG Mingfang，REN Jiahui，ZHANG Yaci，WEI Xuedan，SHEN Aijuan，ZHANG Angke，DUAN Hong
（College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450046，China）

Abstract： 【Objective】Preparation of polyclonal antibody against non-structural protein 1α（NSP1α）provides a material foundation for in-depth research on the NSP1α protein and offers a new insight for the prevention and control porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRSV）infection.【Method】PRRSV NSP1α gene was amplified using pCAGGS-NSP1α-HA plasmid as the template，then the homology of NSP1α gene sequences between SD16 strain and other PRRSV strains，the protein physicochemical properties，amino acid hydrophilicity/hydrophobicity，transmembrane domains，signal peptide sequences，phosphorylation sites，secondary and tertiary structures of proteins were analyzed using bioinformatics online software.Then the polymerase chain reaction（PCR）products were purified and cloned into the pET-28a-His prokaryotic expression vector through EcoR I and Xho I.Next，the pET-28a-NSP1α-His plasmids were transformed into E.coli BL21 （DE3）.The NSP1α protein after induced expression and purification was used to immunize mice to prepare polyclonal antibody against PRRSV NSP1α protein.The reactivity of the prepared polyclonal antibodies was identified using Western blot and indirect immunofluorescence assay （IFA）.Finally，the subcellular distribution of the NSP1α protein was analyzed using Western blot and confocal microscopy.【Result】The results of information analysis showed that the NSP1α protein of PRRSV SD16 strain has 501 amino acids and is an unstable hydrophobic protein；Its sequence has the highest homology with the HLJ strain and the lowest homology with the type I PRRSV strain；NSP1α protein has no signal peptide sequence and transmembrane domain，but may contain 13 phosphorylation sites；The secondary structure mainly includes alpha helices，extended chains，and random coil.The high-purity and active NSP1α protein was used to immunize BALB/c mice，and the serum antibody titer reached 1∶64 000.Western blot and IFA results showed that the prepared polyclonal antibody specifically recognized PRRSV NSP1α protein.And Western blot and confocal microscopy results showed that NSP1α protein is primarily localized in the cell nucleus.【Conclusion】The PRRSV NSP1α protein was expressed and purified，and the mouse derived polyclonal antibody was successfully prepared.The polyclonal antibody has good reactivity and specificity with PRRSV NSP1α protein.

Key words：porcine reproductive and respiratory syndrome virus；non-structural protein 1α；prokaryotic expression；polyclonal antibody；biological characteristics

中图分类号：S852.65

文献标志码：A

文章编号：1000-2340（2025）05-0838-11

引用：张铭芳，任佳慧，张亚慈，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α 原核表达及其多克隆抗体的制备［J］.河南农业大学学报，2025，59（5）：838-848.DOI：10.16445/j.cnki.1000-2340.20250512.001

收稿日期：2024-07-14

接受日期：2025-05-12

基金项目：国家自然科学基金项目（32302871）；河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（232102110101）

作者简介：张铭芳（2002—），女，河南许昌人，硕士研究生，主要从事动物病毒学与免疫学研究，E-mail：zhmingfang0213@163.com。

通信作者：张昂克（1986—），男，河南南阳人，副教授，博士，E-mail：zhangangke1112@henau.edu.cn；段红（1991—），女，河北石家庄人，助理研究员，博士，E-mail：duanhong0924@126.com。

（责任编辑：曾庆东）