猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是重要的人兽共患病病原体，可引起包括脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎、关节炎等多种疾病，对全球养猪业造成了重大经济损失［1-3］。SS是革兰氏阳性菌，根据荚膜多糖（capsule polysaccharides，CPS）的差异，可分为29个血清型［4］。SS2被认为是致病性最强、报告病例最多的血清型［5］。1968年，人感染SS病例被首次报道，而在1990年，中国首次出现SS2菌株感染人的疑似病例［6］。之后，江苏省和四川省分别于1998年和2005年暴发了人感染SS2的疫情［7］。在东南亚地区，SS2也是引起人脑膜炎的主要病原体［8］。除了SS2以外，SS9作为次高致病亚型，已经在中国畜牧业发达地区形成了区域性流行态势［9-12］。SS9逐渐成为中国猪感染链球菌的主要血清型之一［13-14］。随着人感染SS9导致败血性休克的病例被报道［15］，由SS9造成的人兽共患病已经引起相关部门的高度重视。目前，河南省猪场流行的SS血清 型主要以SS2为 主，也 包括SS9［16］；而湖南省、广西壮族自治区等也以SS2、SS9为主［17-18］。由此可见，建立一种针对SS2和SS9感染的快速检测方法十分必要。

目前，SS的微生物学检测方法主要是进行分离培养及生化鉴定等，该方法费时费力，而且结果不稳定，还需要结合其他方法进行验证。免疫学检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）和胶体金免疫层析法（gold immunochromatographic assay，GICA），但ELISA过程复杂，样品制备难度大，耗时较长且灵敏度较低，而GICA则不稳定且灵敏度不高［19］；分子生物学检测方法主要包括PCR技术、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等。刘琪等［20］建立了SS2、SS7和SS9的多重PCR检测方法。李晓月［21］建立了SS2、SS7和SS9的荧光定量PCR检测方法。但是，二者都需要昂贵的精密仪器和专业人员的操作，存在易污染和假阳性等问题。LAMP技术虽然克服了PCR技术的缺点，但引物设计要求复杂，易产生非特异性扩增。

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新型的等温核酸扩增和检测技术［22］，可分为基础RPA（Basic-RPA）、实时荧光RPA、侧向层析条检测RPA、数字RPA和RPA-CRISPR联合检测。该技术基于重组酶和DNA聚合酶的协同作用，重组酶负责将引物插入双链DNA目标中，而聚合酶则沿着模板链延长并合成新链，替换原有互补链，循环重复上述过程达到指数扩增效果［23］。RPA具有反应条件温和（37～42 ℃）、扩增时间短（15～30 min）、操作简便等优点，且只需便携式恒温器，降低了设备成本和复杂性［24-26］。RPA灵敏度高，兼容性强，可检测1～10个拷贝的小DNA靶标，对常见抑制剂具有高耐受性，并可以和下游的荧光检测、侧流免疫层析等方法结合［27］。基于以上优点，RPA被用于病原微生物等多个领域的检测。张闪闪等［28］建立了RPA-LFD方法检测SS，具有较高的灵敏度，但属于定性检测，不能确定血清型。王璐［29］建立了针对SS2的RPA-Cas12a检测方法，灵敏度较高，但只能检测1种血清型。

由于具备高效性、系统性、经济简便性等优点，双重检测方法被广泛应用于病原微生物的检测。马 爱 红［30］和 史 芳 芳 等［31］分 别 建 立 了 双 重LAMP以检测2种不同的病原体，但对于多血清型的病原体的检测来说，该方法还有一定局限性。双重RPA具备了双重PCR的灵敏度高和特异性强的优点，同时又避免了双重PCR和LAMP的缺点，非常适合病原微生物的现场快速检测，尤其对于SS这种多血清型且危害较大的人兽共患病原体。基于此，针对SS2和SS9这2种致病性血清型，本研究以cps2J、cps9H基因为靶基因，构建一种双重Basic-RPA检测方法，对其特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果进行评价，以期为SS的快速诊断和血清分型提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和样品 SS1、SS7和SS9菌株由山东省滨州畜牧兽医研究院沈志强研究员惠赠；SS2菌株由吉林大学雷连成教授惠赠。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）、沙 门 氏 菌（Salmonella，CVCC541）、巴氏杆菌（Pasteurella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC49525）、猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，CVCC259）均由河南科技学院动物科技学院预防兽医学实验室保存。河南省不同地区规模化猪场采集的41份临床症状疑似猪链球菌感染的病猪扁桃体组织由河南科技学院动物医院保存。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA快速提取试剂盒和BHI培养基购自爱必信（上海）生物科技有限公司；THB、TSB、LB培养基、DNA抽提剂购自北京索莱宝科技有限公司；DNA上样缓冲液和50×TAE缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；琼脂糖购自上海贝晶生物技术有限公司；Taq PCR Master Mix Ⅱ 购自天根生化科技（北京）有限公司；TwistAmpTM Basic kit购自TwistDX公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌基因组DNA的提取 将冻存的细菌进行解冻并在固体培养基上划线培养，然后挑取单菌落于液体培养基中培养。THB培养基用于培养SS；BHI培养基用于培养猪胸膜肺炎放线杆菌；TSB培养基用于培养巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌；LB培养基用于培养嗜水气单胞菌、肠致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。使用细菌基因组DNA提取试剂盒对处于对数生长期的细菌的DNA进行提取。用超微量核酸蛋白分析仪（NanoDrop ONEC，美国赛默飞世尔科技公司）测定各菌种DNA的质量浓度和纯度。

在进行双重Basic-RPA检测时，将所提取的各个细菌基因组DNA的质量浓度稀释至101 mg·L-1，将SS2和SS9进行同体积混合，然后采用10倍倍比稀释法，进行梯度稀释，最终质量浓度依次为101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 mg·L-1。

1.2.2 引物的设计与合成 不同血清型的荚膜结构差异主要由CPS基因簇所决定，因此，本研究选取SS2和SS9特异的荚膜多糖基因序列（cps2J，Accession Number：DQ410853.1；cps9H，Accession Number：JX986798.1）作 为 靶 基 因。从Gen-Bank获取靶基因的基因序列并用DNAStar软件进行比对分析，并通过NCBI Blast比对，根据《Twist-Amp® DNA扩增试剂盒分析设计手册》中引物设计的要求，使用软件Primer5.0进行引物设计，共设计5对引物（表1），均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 SS2 和SS9 Basic-RPA 引物序列
Table 1 The primer sequence of SS2 and SS9 Basic-RPA

引物名称Primer name CPS2J212序列（5′—3′）Sequence目的片段/bp Fragment size 214 CPS2J216 216 CPS9H222 222 CPS9H458 458 CPS9H304 F：GGAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAATAAA R：AAAAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACAAATC F：GTTTGGAATACGCAGAGCAAGATGGTAGAA R：AAGTAGCAAGTAACCCTCCCGACAAATCAC F：TCAGACTGCATACAGGGCAGAAGTGCTAGG R：AAACGACTCCCCAAAGAATTGTGAAACGAC F：AGGGCAGAAGTGCTAGGTGATATGATAAA R：ATCCCAAATACGCTATGTAGACGAAGTGC F：AGACTGCATACAGGGCAGAAGTGCTAGGTG R：ATCCTTTCTACATCATCATTTTCTCCATCACAA 304

1.2.3 单重Basic-RPA引物的筛选 采用PCR对表1的引物进行初步筛选，随后根据Basic-RPA反应试剂盒说明书配置反应体系，反应总体积为50 μL。缓冲液29.5 μL，ddH2O 11.2 μL，上游引物2.4 μL，下游引物2.4 μL，模板2 μL，Mg2+ 2.5 μL。在39 ℃反应20 min，然后向各反应管中加入等体积DNA抽提剂进行DNA纯化，离心机（5810R，德国Eppendorf公司）8 000 r·min-1离心2 min，上清液即为纯化的DNA。取5 μL纯化的DNA上样，进行琼脂糖凝胶（EPS300，上海天能生命科学有限公司）电泳分析，恒压110 V电泳30 min。选择条带最清晰、无杂带且阴性对照无条带的引物进行后续研究。

1.2.4 双重Basic-RPA引物体积的优化 同时添加多对引物会出现非特异性扩增，因此，对双重Basic-RPA体系进行优化，保证试验的稳定性。使用控制变量法对双重Basic-RPA反应的引物体积比进行了优化。将2种血清型的引物体积设置了9组优化体系，即V（CPS2J212/μL）∶V（CPS2J212/μL）分别为2.4∶0、2.4∶0.6、2.4∶1.2、2.4∶1.8、2.4∶2.4、1.8∶2.4、1.2∶2.4、0.6∶2.4和0∶2.4。扩增结束后，加入等体积的DNA抽提剂进行提纯，用质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，恒压110 V电泳30 min，确定引物最佳体积比。

1.2.5 双重Basic-RPA反应时间和温度的优化使用1.2.4筛选的引物最佳体积，分别对反应时间和温度进行优化。反应时间分别选择5、10、15、20、25、30、35、40 min；反应温度分别选择25、30、35、37、39、45 ℃。上述反应产物分别用质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，恒压110 V电泳30 min，筛选最佳反应时间和温度。

1.2.6 双重Basic-RPA灵敏度试验 将SS2和SS9相同体积的DNA进行混合，采用10倍系列稀释法，梯度稀释为10-7～100 mg·L-1 8个质量浓度，用所构建的双重Basic-RPA法进行检测，考察最低检出限，同时进行PCR检测，将检测结果进行比较。

1.2.7 双重Basic-RPA特异性试验 用1.2.5优化的反应条件分别对SS1、SS7、肠致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌和嗜水气单胞菌的DNA进行双重Basic-RPA反应，同时设SS2和SS9混合样本、单独的SS2和SS9样本为阳性对照，以检验该方法的特异性。

1.2.8 双重Basic-RPA重复性试验 SS2和SS9的DNA以等体积混合，且质量浓度分别为10.0、1.0、0.1 mg·L-1进 行 双 重Basic-RPA扩 增，重 复3次并对3组试验的扩增结果进行分析。

1.2.9 双重Basic-RPA临床样品检测 从河南省不同地区规模化猪场采集了41份临床症状疑似猪链球菌感染的病猪组织样品。提取样品DNA并以此为模板，按最适反应条件进行Basic-RPA检测。同时使用细菌分离培养和常规PCR进行对照检测。将检测结果进行比较，验证双重Basic-RPA方法的检测效果。试验按照河南科技学院动物福利与研究伦理委员会批准的试验实践和标准进行（编号：202009-023）。

2 结果与分析

2.1 SS2 和SS9 单重Basic-RPA 引物 筛选

经过PCR初步筛选，分别选择CPS2J212F/CPS2J212R和CPS9H304F/CPS9H304R作 为SS2和SS9的引物，并以对应菌株的DNA为模板，进行单重Basic-RPA反应。SS1、SS7和其他7种细菌DNA设为对照组。结果如图1所示，无论是PCR还是单重Basic-RPA，SS2和SS9都只出现1条特异 性 条带，无非特异性条带出现。这说明所选引物特异性好，和SS其他血清型及7种病原体均无交叉反应。

图1 SS2和SS9 PCR与单重Baisc-RPA特异性对比
Fig.1 SS2 and SS9 PCR and single Basic-RPA specificity results

A：SS2 PCR 特异性结果；B：SS2 RPA 特异性结果；C：SS9 PCR 特异性结果；D：SS9 RPA 特异性结果。M：1 000 DNA Ladder；1～12：SS2/SS9阳性对照、SS1、SS7、肠致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、嗜水气单胞菌和阴性对照。
A：SS2 PCR specific results；B：SS2 RPA specific results；C：SS9 PCR specific results；D：SS9 RPA specific results.M：1 000 DNA Ladder；1-12：SS2/SS9 positive control，SS1，SS7，Enteropathogenic Escherichia coli，Salmonella，Haemophilus parasuis，Staphylococcus aureus，Actinobacillus pleuropneumoniae，Pasteurella，Aeromonas hydrophila and negative control.

2.2 SS2/9 双重Basic-RPA 引物体积分析

保持其他条件不变，对9组不同引物体积进行反应。结果如图2所示，条带亮度随着2种引物体积 的 降 低 而 逐 渐 增 强。当V（CPS2J212/μL）∶V（CPS9H304/μL）为2.4∶1.8时，SS2和SS9的 电 泳条带亮度较为一致，随后亮度逐渐减弱。经过重复试验对比，本研究最终选定V（CPS2J212/μL）∶V（CPS9H304/μL）为2.4∶1.8作为引物最佳体积。

图2 SS2/9双重Basic-RPA引物体积优化
Fig.2 Optimization of primervolume of SS2/9 dual Basic-RPA detection methods

M：1 000 DNA Ladder；1～9：引物体积V（CPS2J212/μL）∶V（CPS9H304/μL）分别为2.4∶0、2.4∶0.6、2.4∶1.2、2.4∶1.8、2.4∶2.4、1.8∶2.4、1.2∶2.4、0.6∶2.4 和0∶2.4。
M：1 000 DNA Ladder；1-9：Primer volume V（CPS2J212/μL）∶V（CPS9H304/μL）are 2.4∶0，2.4∶0.6，2.4∶1.2，2.4∶1.8，2.4∶2.4，1.8∶2.4，1.2∶2.4，0.6∶2.4，and 0∶2.4，respectively.

2.3 SS2/9 双重Basic-RPA 反应温度和时间分析

根据2.2所得到的引物体积，分别对反应温度（25、30、35、37、39、45 ℃）和反应时间（5、10、15、20、25、30、35、40 min）进行优化。从图3-A中可以看出，从25 ℃ 开始，条带亮度逐渐增强，39 ℃时条带亮度达到最强，之后逐渐变弱，因此选择39 ℃为最佳反应温度。从图3-B可以看出，从5 min开始，条带亮度逐渐增强，到20 min亮度最强，之后亮度略有减弱，但差异不大，从反应体系的时效性考虑，反应时间选择20 min。

图3 SS2/9双重Basic-RPA反应温度及时间优化
Fig.3 Optimization of reaction temperature and time of SS2/9 dual Basic-RPA detection methods

A：反应温度优化；1～6：反应温度分别为25、30、35、37、39、45 ℃。B：反应时间优化；1～8：反应时间分别为5、10、15、20、25、30、35、40 min。M：1 000 DNA Ladder。
A：Reaction temperature optimization；1-6：Reaction temperature 25，30，35，37，39，45 ℃.B：Reaction time optimization；1-8：Reaction time 5，10，15，20，25，30，35，40 min.M：1 000 DNA Ladder.

2.4 SS2/9 双重Basic-RPA 灵敏度分析

双重Basic-RPA与双重PCR的灵敏度检测结果如图4所示，随着模板DNA质量浓度的降低，条带亮度都逐渐减弱。对于双重Basic-RPA，当模板质量浓度为1×10-3 mg·L-1时，条带仍可见，如图4-A所示。对于双重PCR，模板质量浓度在1×10-2 mg·L-1后无可见条带，如图4-B所示。由此可见，双重Basic-RPA方法的灵敏度优于双重PCR方法。

图4 SS2/9双重Basic-RPA与PCR灵敏度对比
Fig.4 Sensitivity results of SS2/9 dual Basic-RPA and PCR

A：双重Basic-RPA 灵敏度结果；B：PCR 灵敏度结果。M：1 000 DNA Ladder；1～9：模板DNA 质量浓度分别为1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 mg·L-1；10：阴性对照。
A：Dual Basic-RPA sensitivity results；B：PCR sensitivity results；M：1 000 DNA Ladder；1-9：The template DNA concentrations 1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 mg·L-1；10：Negative control.

2.5 SS2/9 双重Basic-RPA 特异性分析

使用双重PCR及双重Basic-RPA检测体系进行特异性检测，结果如图5所示。SS9和SS2阳性对照、SS9阳性对照和SS2阳性对照均出现清晰明亮的条带，阴性对照、SS1、SS7、肠致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌和嗜水气单胞菌未出现条带，和双重PCR的检测结果一致。这说明建立的双重Basic-RPA方法特异性良好。

图5 SS2/9双重Basic-RPA与PCR特异性对比
Fig.5 Specific results of SS2/9 dual Basic-RPA and PCR

A：PCR 特异性结果；B：双重Basic-RPA 特异性结果；M：1 000 DNA Ladder；1～13：SS2/9 阳性对照、SS9 阳性对照、SS2 阳性对照、阴性对照、SS1、SS7、肠致病性大肠杆菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌和嗜水气单胞菌。
A：PCR specific results；B：Dual Basic-RPA specific results；M：1 000 DNA Ladder；1-13：Positive control of SS2/9，SS9 positive control，SS2 positive control，negative control，SS1，SS7，Enteropathogenic Escherichia coli，Salmonella，Haemophilus parasuis，Staphylococcus aureus，Actinobacillus pleuropneumoniae，Pasteurella and Aeromonas hydrophila.

2.6 SS2/9 双重Basic-RPA 重复性分析

重复性试验结果如图6所示，SS2和SS9的3个不同质量浓度均扩增出条带，而且每个质量浓度的条带亮度基本一致。这说明本研究建立的Basic-RPA方法稳定性好。

图6 SS2/9双重Basic-RPA重复性结果
Fig.6 Repeatability test results of SS2/9 dual Basic-RPA

A：第1 次扩增；B：第2 次扩增；C：第3 次扩增。M：1000 DNA Ladder；1～3：模板DNA 质量浓度分别为1×101、1×100、1×10-1 mg·L-1。
A：The first amplification；B：The second amplification；C：The third amplification.M：1000 DNA Ladder；1-3：The template DNA concentrations 1×101、1×100、1×10-1 mg·L-1.

2.7 SS2/9 双重Basic-RPA 临床样品检测分析

对采集的41份猪组织样品，按照最佳反应条件进行双重Basic-RPA检测，同时与细菌培养、常规PCR和单重Basic-RPA相比较，结果如表2所示。细菌培养方法检测出5个阳性样本，常规PCR方法共检测出8个阳性样本，其中，单独感染2型5份，9型2份，2/9共感染1份；单 重Basic-RPA方法共检测出10个阳性样本，其中，单 独 感 染2型6份，9型2份，2/9共 感 染2份；双重Basic-RPA方法共检测出10个阳性样本，其中，单 独 感 染2型6份，9型2份，2/9共 感 染2份。由此可知，SS2/9双重Basic-RPA方法与单重Basic-RPA方法检出率一致，优于细菌培养方法和常规PCR方法。

表2 不同检测方法对SS2/9 临床样品检测结果的对比分析
Table 2 Comparative analysis of detection results for SS2/9 clinical samples using different detection methods

检测方法Test method细菌培养Bacterial isolation常规PCR Conventional PCR单重Basic-RPA Single Basic-RPA双重Basic-RPA Dual Basic-RPA阳性病例数/份Number of positive cases 5阳性率/%Positive rate 12.2 8（2 型感染5，9 型感染2，2/9 型共感染1）19.5 10（2 型感染6，9 型感染2，2/9 型共感染2）24.4 10（2 型感染6，9 型感染2，2/9 型共感染2）24.4

3 结论与讨论

SS血清型较多，毒力因子复杂，临床症状多样，还常和其他病原体如猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌等混合感染［32-33］。SS不仅危害养猪业，还威胁公共卫生和食品安全。除了SS2外，SS9、SS7和SS1等也具有致病性，且各个血清型之间没有交叉保护性。因此，SS血清型的快速诊断对于SS的防控具有重要意义［34］。

本研究在单重Basic-RPA检测的基础上，以cps2J、cps9H基因为靶标基因，设计了2对特异性引物，建立了SS2和SS9双重Basic-RPA检测。和单重Basic-RPA检测方法相比，双重Basic-RPA检测能同时检测SS的2种血清型，减少了检测时间，降低了检测成本，提高了检测效率［35］。双重Basic-RPA检测方法要严格处理好反应条件的兼容性，如多个引物量的配比。本研究通过引物体积优化试验 发现，当V（CPS2J212/μL）∶V（CPS9H304/μL）在2.4∶1.8时，扩增效率高，且高于PCR，这为后续开发更多血清型的联检体系提供了重要参考。当多对引物存在时，需要考虑各对引物的扩增效率，这和反应温度直接相关。本研究中cps2J212与cps9H304组合在39 ℃达到最高扩增效率。时间梯度试验表明，有效扩增在20 min完成，既保证了反应物充分反应，又避免了时间过长导致的非特异性扩增或反应物过度消耗，实现了检测效率与准确性的平衡。

特异性方面，通过设计引物，分别以SS2/9混合样品、SS2单个样品、SS9单个样品为阳性对照，以SS1、SS7和其他7种常见病原菌作为检测对象，结果仅目标菌阳性对照出现明显条带，其他菌都没有条带出现，充分证明该方法对SS2和SS9具有高度特异性。引物CCPS2J212与CPS9H304在SS2和SS9检测中表现出色，其在阴性对照中无扩增条带，有效避免了假阳性结果的出现。这一特性使得在临床复杂的SS感染环境中，能够准确识别出SS2和SS9，为SS的精准诊断提供了坚实保障。

灵敏度方面，本研究建立的双重Basic-RPA检测方法的检测限达到1×10-3 mg·L-1，展现出良好的低质量浓度样本检测能力。吴静波等［36］建立的双重PCR技术对SS通用型和2型的检测限为5拷贝·μL-1。靳曼玉等［37］建立的TaqMan荧光定量PCR对SS的检测限为75.34拷贝·μL-1，均低于该方法的灵敏度。和PCR相比，RPA的反应过程简单且迅速，反应温度恒定，影响因素少，有助于灵敏度的提高。双重Basic-RPA检测方法的高灵敏度意味着在SS发病早期，病原菌载量较低时，也能够及时、准确地检测到，为疾病的早期防控争取宝贵时间，有效降低病原菌传播风险，减少SS的大规模爆发。

本研究建立的双重Basic-RPA检测方法与LAMP技术相比具有更灵活的设计空间，LAMP需要4条引物且对茎环结构有严格要求，而本方法仅用2对标准引物即实现双重检测。与微流控芯片联用PCR技术相比［38］，本方法不需要精密温控设备，检测成本降低约70%。但本方法仍存在2个问题。一是扩增产物需电泳确认，限制了现场即时检测应用；二是多重检测时引物间存在竞争抑制，需通过化学添加剂改善反应兼容性。因此，基于现有成果，后续研究可联合其他检测技术如CRISPR/Cas12a系统或PfAgo体系进行荧光信号输出，建立多重检测体系，以减少目前研究的部分局限性，从而开发更加高效灵敏的新型检测技术。

本研究构建了SS的2种血清型（SS2/9）的双重Basic-RPA检测方法，实现了SS的2种血清型的同时检测。该方法反应时间控制在20 min；检测限低至1×10-3 mg·L-1，低于传统PCR检测限；特异性检测显示与其他7种病原菌无交叉反应；重复性结果显示其重复性好；在更短的时间内准确识别出41例临床样本中的混合感染病例。本研究构建的双重Basic-RPA检测方法为SS的精准防控提供了技术支撑，为开发更复杂的多联检体系奠定了基础。

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Establishment and application of dual Basic-RPA detection method for Streptococcus suis serotype 2 and serotype 9

ZHANG Huihui，WANG Kexin，LI Yanwei，WEI Xiaobing，WANG Lei，HU Jianhe，DING Ke，LIU Mingcheng，XIA Xiaojing
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，China）

Abstract： 【Objective】This research is conducted to develop a dual rapid detection method for Streptococcus suis serotype 2 （SS2）and serotype 9 （SS9），thereby providing technical support for monitoring the prevalence and spread of Streptococcus suis （SS）.【Method】Taking the Capsular Polysaccharide 2J gene （cps2J）specific to SS2 and the Capsular Polysaccharide 9H gene （cps9H）specific to SS9 as target respectively，specific primers and probes were designed to optimize the reaction system and conditions，and a rapid detection technology were established for basic recombinant enzyme polymerase isothermal amplification （Basic-RPA）.Furthermore，the specificity，sensitivity，repeatability，and clinical applicability of this method were evaluated.【Result】The primers for the established SS2/9 dual Basic-RPA detection method are CPS2J212 and CPS9H304，with a primer volume ratio of V（CPS2J212/μL）∶ V（CPS9H304/μL）at 2.4 ∶ 1.8.The reaction is performed at 39 ℃ for 20 min.The specificity results show that this method had no cross-reaction with other common pathogens and had good specificity.The sensitivity results showed that the detection limit of this method for SS2/9 reached 1×10-3 mg·L-1，which is more sensitive than that of conventional PCR at 1×10-2 mg·L-1.Repeatability results showed the method has a good stability.The double Basic-RPA method was employed to analyze 41 clinical samples，yielding a detection rate of 24.4%.This result was consistent with that obtained using the single Basic-RPA method.Furthermore，the detection rate achieved by the double Basic-RPA method was higher than those obtained by the bacterial isolation method（12.2%）and conventional PCR method （19.5%）.【Conclusion】The constructed dual Basic-RPA detection method of SS2/9 has good specificity and stability and high sensitivity，providing a new method for the rapid diagnosis and serotyping of SS and laying the foundation for the development of a more complex multiplex detection system.

Key words：Streptococcus suis；Basic-recombinase polymerase amplification （Basic-RPA）；capsule polysaccharides；serotype；dual detection

中图分类号：S852.61

文献标志码：A

文章编号：1000-2340（2025）05-0849-10

引用：张慧辉，王可心，李艳伟，等.猪链球菌2 型和9 型双重Basic-RPA 检测方法的构建与应用［J］.河南农业大学学报，2025，59（5）：849-858.DOI：10.16445/j.cnki.1000-2340.20250828.002

收稿日期：2025-05-29

接受日期：2025-08-28

基金项目：河南省高校科技创新人才项目（23HASTIT046）；河南省优秀青年科学基金项目（232300421031）；国家自然科学基金面上项目（32172876，32473070）

作者简介：张慧辉（1970—），女，河南鲁山人，副教授，硕士，主要从事动物病原与新兽药研发，E-mail：zhh-05@163.com；王可心（1999—），女，河北徐水人，硕士，主要从事动物病原与新兽药研发，E-mail：wkx15038306051@163.com。

通信作者：刘明成（1980—），男，河南信阳人，实验师，博士，E-mail：liumc@hist.edu.cn；夏小静（1986—），男，安徽庐江人，副教授，博士，硕士生导师，E-mail：quik500@163.com。

（责任编辑：曾庆东）