DOI:10.16445/j.cnki.1000-2340.20250126.001
中图分类号:S513
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玉米自交系ldhs1叶片早衰特性分析及QTL定位
叶片衰老通常发生在植物生长发育的最后阶段，与物质的分解和再利用有关，同时伴随着一系列复杂的生理和生化方面的转变［1］。通过叶片衰老，植物会将叶片内的营养物质回收并重新分配，输送到正在生长的器官或储存到植物体内的组织中，为下一代提供养分或确保植物在严酷时期的生存［2］。早衰是衰老的异常表型，当植物内部或环境因素导致其生理代谢功能失调，叶片的衰老过程加速，致其失去绿色、变得枯萎，光合作用活动过早结束，植物体内可再利用的有机物减少，供应不足影响了谷物的生长和发育，严重影响作物产量的增加和品质的提升［3-4］。玉米（Zea mays L.）作为一种关键的粮食作物、饲料来源及多种工业产品的原料，其产量影响到国家粮食安全和畜牧业的发展［5］。玉米产量与叶片的光合作用存在密切关系，玉米生长后期是籽粒形成的关键期，籽粒中大部分干物质的积累主要来源于光合作用，叶片衰老对产量有着重要影响［6］。
借助分子生物学和基因工程领域的快速进步，通过遗传学、转录组学、代谢组学和植物激素等方面的研究已经鉴定到了多个导致早衰和延迟衰老的基因及相关的信号途径［7-9］。研究表明，叶片细胞在衰老过程中经历了大量的结构和生化变化，如光合作用降低、分解代谢反应增强、积累的活性氧（ROS）和抗氧化酶活性降低［10-13］。筛选影响衰老相关基因（SAGs）的正向遗传突变体及应用反向遗传学的方法，可以用来揭示一系列调控叶片衰老的分子途径和信号网络。基因表达分析和遗传研究表明，大多数植物激素对叶片衰老具有调节作用［14］，其中，乙烯（ethylene，ET）、水杨酸（salicylic acid，SA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、独脚金内酯（strigolactones，SL）和油菜素类固醇（brassinosteroid，BR）这些激素在叶片衰老中起到促进作用［15-16］，而生长素（auxin，IAA）、细胞分裂素（cytokinin，CK）和赤霉素（gibbere-llic acid，GA）这几种植物激素具有延缓衰老过程的作用，它们可以帮助维持叶片的活力，推迟其进入衰老阶段［17-18］。多种转录因子，包括NAM、ATAF、NAC、WRKY、MYB、C2H2锌指蛋白、bZIP和AP2，通过控制衰老相关基因的开启或关闭，干预叶片从成熟到衰老的转变［19］。如在拟南芥中，WRKY47通过调控细胞程序性死亡（PCD）相关的基因BFN1和MC6，进而调节年龄依赖性的叶片衰老［20］。越来越多的证据显示，叶片衰老还受到表观遗传方面的调控，这包括DNA分子上的甲基化模式、组蛋白的化学修饰，以及染色质结构的动态重塑等非共价相互作用［21］。如逆转录转座子NMR19-4通过调控PPH基因的甲基化水平，间接控制叶绿素降解酶的活性，从而参与叶片衰老的调控［22］。此外，蛋白质代谢和环境胁迫也参与植物叶片衰老的调控。例如，玉米早衰相关基因See2α 和See2β 编码半胱氨酸蛋白酶，在抽穗过程中控制氮素的分配导致叶片的衰老［23］；拟南芥分泌肽CLE14可以使NAC家族的JUB1转录激活，JUB1是一种衰老负调控因子，CLE14过表达促进JUB1介导的叶片ROS清除来抑制叶片衰老［24］。由此可见，植物的衰老所涉及的调控基因数量众多，它的代谢网络相当复杂交错，这是一个非常繁杂且关键的生命进程。
目前叶片衰老相关研究是通过衰老相关的突变体鉴定衰老基因解析相关的机制，衰老基因鉴定较多的是拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sative），玉米的相关研究较少。因此，进一步研究和克隆与玉米早衰性状相关的基因，并深入理解其背后的遗传机制，有利于建立和优化植物早衰的遗传调控网络体系，对延缓衰老、抗衰老的玉米新品种的选育和保证粮食安全具有重要意义。本研究以在玉米单倍体育种技术进行创制的双单倍体（dihaploid，DH）系中发现的具有早衰性状的自交系ldhs1作为研究材料，持绿型自交系L521为对照，对其田间生长过程进行表型鉴定；并对ldhs1进行了生理特征特性和细胞学观察；利用混合分组测序分析法（bulkedsegregant analysis sequencing，BSA-seq）技术，对亲本极端表型混池测序分析得到候选区间，通过开发新的分子标记进一步缩小候选区间，以期挖掘新的早衰基因，通过基因功能解析为玉米育种和生产提供理论指导和技术支持，便于培育更具优良性状的玉米品种。
1 材料与方法
1.1 试验材料
叶片早衰自交系ldhs1源于利用玉米单倍体育种技术进行资源创制的DH系。自交系ldhs1及其自交后代于2017—2024年在海南和河南连续多年多点种植均表现出叶片早衰，呈现出稳定遗传。以自交系ldhs1为父本，与持绿性良好的优良自交系L521杂交获得F1，其自交后产生F2分离群体，用于玉米自交系早衰性状的数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）定位。试验材料种植于河南农业大学科教园和海南南繁基地，水肥、病虫害管理同大田。
1.2 试验方法
1.2.1 农艺性状调查 在成熟期，随机选取早衰自交系ldhs1及持绿自交系L521各15株，对植物的农艺性状，如植株高度、千粒质量、籽粒结实率和生长周期等进行详细的研究和记录，并使用Excel软件进行数据分析，以确定这些性状之间是否存在统计学上的显著差异。
1.2.2 叶绿素含量测定 在苗期和自交系出现早衰性状时，分别随机选取自交系ldhs1与对照L521倒一叶，把主脉去除掉，称量大约0.2 g的新鲜叶片，然后放置在研钵当中进行充分研磨，在这个过程中加入5 mL体积分数95%的乙醇，一直研磨到样品呈现白色，过滤之后使用体积分数95%的乙醇将其定容至25 mL，放置在避光环境下抽提12 h以上。使用体积分数95%乙醇作为空白的参照标准，通过紫外分光光度计（mapada-UV-1100，上海美普达仪器有限公司）在665、649和470 nm这几个特定波长下对样品的吸光度进行测定。每个样本都独立进行3次生物学重复以确保结果的可靠性和重复性。随后，根据特定的计算公式来处理这些吸光值数据［25］。
1.2.3 生理指标测定 在自交系出现早衰性状时，随机选取授粉后第10天的自交系ldhs1与对照L521倒一叶，首先，精确称量约0.1 g的新鲜植物叶片并放入研钵内，随后加入1 mL的提取液，然后在冰上仔细研磨以确保充分破碎细胞释放内容物。在4 ℃的条件下，以12 000 r·min-1的速度离心10 min（centrifuge S420R，Eppendorf），以便分离出细胞碎片和未破碎的残留物。离心后吸取上清液至新的离心管中，同时保持在冰上以避免任何进一步的生化反应。之后，使用试剂盒（POD-2-Y，苏州科铭生物技术有限公司）按照制造商的说明，对上清液中的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量进行定量分析。为了确保结果的准确性和可重复性，每种样本的测定都要独立进行3次［26］。
1.2.4 透射电子显微镜观察 自然环境下，当自交系ldhs1叶片出现早衰表型时，分别选取自交系ldhs1与对照L521的倒一叶，将样品固定在体积分数为2.5%戊二醛（C5H8O2）中，用0.1 mol·L-1磷酸盐（H2PO4-/HPO42-）缓冲液漂洗，之后固定在质量分数1%锇酸（H2OsO4）中并在磷酸盐缓冲液中冲洗2次，经过一系列的乙醇梯度脱水及丙酮（C3H6O）置换，将样品包埋在Spurr’s树脂中，用切片机获得的超薄切片（50～70 nm）用醋酸铀和柠檬酸铅染色，并使用透射电子显微镜（Tecnai G2 Spirit Bio，捷克FEI）来观察叶绿体超微结构。
1.2.5 QTL定位 以自交系L521为母本，早衰自交系ldhs1为父本杂交获得F1，F1植株自交得到F2定位群体。对F2群体表型进行调查，选择30株早衰极端表型单株和30株正常植株表型单株分别构建早衰池和最晚衰老池，同时建立L521和ldhs1亲本池。借助HiSeq2500二代测序平台来开展上机测序工作，测序的深度全都为30X。使用SNP标记和InDel标记，通过BSA，进行基因与表型的连锁分析，通过SNP-index算法对早衰性状的基因进行初定位。随后，根据BSA所检测到的变异，对发现的InDel变异位点进行仔细筛选和过滤，以开发出可用于遗传分析的多态性分子标记，使用F2分离群体进行精细作图，进一步缩小LDHS1基因的区间。
2 结果与分析
2.1 玉米自交系ldhs1 早衰性状的表型分析
早衰自交系ldhs1在授粉前与对照L521无明显的表型差异，所有叶片在色泽上均为绿色（图1-A）；在授粉后第10天，ldhs1从顶部开始的倒一叶开始表现出早衰症状，由叶尖变黄干枯扩展到叶片的中部和下部，直至整个叶片出现干枯黄化（图1-B）；随着植株的不断生长，在授粉后第17天，从顶部开始的倒二叶和倒三叶出现黄化衰老（图1-C）；在授粉后第24天，植株穗上所有叶片均出现黄化早衰（图1-D）；最后一直蔓延到整个植株，导致整个植株干枯，而同时期的L521所有叶片表型和生长均正常。通过对自交系ldhs1和L521成熟期的农艺性状进行分析，结果显示，与L521相比，ldhs1的株高、生育期、结实率和千粒质量都在不同程度上降低（图2）。其中，L521的平均株高为172.77 cm，而ldhs1的平均株高是163.15 cm，差异显著（图2-A）；ldhs1的生育期缩短了30 d，结实率和千粒质量分别降低了18.22%和25.41 g，均达到极显著水平（图2-B—D），表明自交系ldhs1的早衰性状对其产量产生了一定的影响。
图1 自交系ldhs1和L521植株的表型比较
Fig.1 Phenotype comparison of inbred line ldhs1and L521 plants
A：授粉前的植株；B：授粉后10 d 的植株；C：授粉后17 d 的植株；D：授粉后24 d 的植株。
A：Plants before pollination；B：Plants at 10 days after pollination；C：Plants at 17 days after pollination；D：Plants at 24 days after pollination.
图2 自交系L521和ldhs1的农艺性状
Fig.2 Agronomic traits of inbred line L521 and ldhs1
*表示在0.05 的水平上存在显著差异，**表示在0.01 的水平上存在极显著差异。
* indicates a significant difference at the level of 0.05，** indicates a significant difference at the level of 0.01.
2.2 玉米自交系ldhs1 的生理分析
2.2.1 玉米自交系ldhs1的光合色素含量分析光合色素是植物进行光合作用的关键色素，本研究比较了在大田条件下生长的持绿自交系L521和早衰自交系ldhs1，选择植物生长早期（苗期）和晚期（衰老时期）的叶片，确保取样部位相同，然后测量这些叶片在不同发育阶段的光合色素水平。结果显示，在苗期，ldhs1的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素质量分数与L521相比无明显差异（图3-A）；而在衰老时期，ldhs1的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素的质量分数分别极显著降低了78.62%、70.57%、54.24%和79.38%（图3-B），且相比于苗期，衰老时期ldhs1的叶绿素各组分质量分数分别降低了85.39%、74.88%、58.41%和85.44%，均达到极显著水平（图3-C）。由此可推测，玉米自交系ldhs1中叶绿素发生降解，使光合作用降低，造成叶片早衰。
图3 叶绿素各组分质量分数比较
Fig.3 Comparison of mass fractions of chlorophyll components
**表示在0.01 的水平上存在极显著差异。下同。
** indicates a significant difference at the level of 0.01.The same as below.
2.2.2 玉米自交系ldhs1叶绿体超微结构观察为了深入分析自交系ldhs1在早衰现象中的叶绿体结构变化，本研究选择了2个关键的生长阶段苗期和衰老期，使用透射电子显微镜对ldhs1自交系和对照品种L521的叶绿体进行了详细的超微结构观察。研究结果指出，与对照L521相比，在苗期，ldhs1的叶绿体排列、类囊体结构以及形态大小均正常，无明显差异（图4-A—B）；在授粉后第10天，ldhs1的叶肉细胞内部破坏严重，叶绿体膜降解，叶绿体内部基粒和基质解体，叶绿体中充满了大量的嗜锇性颗粒，同时在叶肉细胞中也观察到一些较大的嗜锇性颗粒和脂滴（图4-C—D），这表明叶片的衰老现象可能与叶绿体的异常发育相关。
图4 ldhs1与L521叶绿体超微结构
Fig.4 Chloroplast ultrastructure of ldhs1 and L521
A，B：ldhs1 与L521 在苗期的叶绿体超微结构图；C，D：ldhs1 与L521 在衰老时期的叶绿体超微结构图。CW：细胞壁；C：叶绿体；CE：叶绿体膜；CP：类囊体；OG：嗜锇颗粒。
A，B：Chloroplast ultrastructure of ldhs1and L521 at seedling stage；C，D：Chloroplast ultrastructure of ldhs1and L521 at senescence stage.CW：Cell wall；C：Chloroplast；CE：Chloroplast membrane；CP：Thylakoid；OG：Osmium granule.
2.2.3 玉米自交系ldhs1早衰生理指标变化分析 研究显示，抗氧化酶活性的降低会导致活性氧积累从而损害叶片细胞结构，引发叶片的衰老。鉴于此，本研究全面地分析了早衰自交系ldhs1和持绿自交系L521的抗氧化生理指标变化。结果显示，与L521相比，在授粉后第10天ldhs1的叶片SOD和POD的活性差异极显著，分别降低了50.85%和24.22%（图5-A—B），这意味着自交系ldhs1清除活性氧的能力下降，导致活性氧在细胞内积聚。在叶片衰老的进程中，细胞膜中的脂质会经历氧化作用，而MDA属于其中的一种主要产物，从结果来看，ldhs1的MDA摩尔质量显著比L521高，升高了26.32%（图5-C），表明ldhs1的脂质过氧化程度较高，进一步证明了其早衰的生理特征。
图5 ldhs1和L521的生理指标
Fig.5 Physiological parameters of ldhs1 and L521
2.3 玉米自交系ldhs1 早衰性状的QTL 定位
以ldhs1/L521的F2群体作为初步定位群体，利用BSA法分别构建极端早衰池和最晚衰老池，与亲本L521和ldhs1分别进行二代重测序，把测序所得结果与参考基因组B73 V5版进行对比，从而得到高质量的SNP位点，通过SNP-index算法将早衰基因定位在1号染色体上，其中区间长度为11.97 Mb，共包含293个基因（图6）。
图6 Δ（SNP-Index）的染色体分布图
Fig.6 Distribution of Δ（SNP-Index）on chromosomes
橙色曲线是95%置信区间的阈值线，绿色曲线是99%置信区间的阈值线。
The orange and green curves are the threshold lines for the 95% and 99% confidence intervals，respectively.
为了更深入地精细定位目标基因，本研究开发了22对在ldhs1、L521和F1代单株间有多态性的InDel标记，利用F2分离群体的609个单株对LDHS1基因进行精细定位，最后把早衰基因确定在indel-12和indel-13这2个标记之间，其物理距离是1.06 Mb（图7）。参考玉米基因组注释计划数据库MaizaGDB（https：//maizegdb.org/），在 这 个 区 间 里共包含21个候选基因。而对于候选基因的确立还需要进一步展开序列分析以及验证。
图7 InDel标记在1号染色体的遗传连锁图谱
Fig.7 Genetic linkage map of InDel markers on chromosome 1
左侧为1 号染色体InDel 标记遗传图谱，右侧为对应LOD 曲线且LOD 阈值为2.5。
The left side is the genetic map of chromosome 1 InDel marker，the right side is the corresponding LOD curve，and the LOD threshold is 2.5.
3 讨论与结论
玉米叶片早衰最明显的变化是叶片颜色的变化，通常由叶边缘逐渐向内黄化，叶片出现褐色斑点并持续增多等表型，最终整株叶片都会走向衰老死亡。本研究表明，在授粉之前，发生叶片早衰的自交系ldhs1与健康正常的植株相比，并没有显著的区别或变化，在授粉后第10天开始出现衰老现象，植株表现为自上而下的叶边缘逐渐向内黄化早衰，最后整株死亡。该早衰表型与前人研究的表型均不相同，是一个新的叶片早衰自交系。
叶片衰老伴随着一系列生理反应以及细胞结构的改变，如叶绿体被降解、光合特性变弱、抗氧化系统的衰退、活性氧积聚，以及细胞膜脂质过氧化的加剧等［27-28］。本研究发现，自交系ldhs1出现衰老时，相比于持绿型自交系L521，其叶绿素a的质量分数下降了78.62%，叶绿素b的质量分数下降了70.57%，类胡萝卜素的质量分数下降了54.24%，而总叶绿素的水平更是大幅度下降了近80%，这种叶绿素质量分数的显著减少表明叶绿体的降解过程已经开始，会加剧叶片衰老的信号传导，形成过度积聚的活性氧。过氧化氢和超氧阴离子是植物细胞内2种主要的活性氧形式，它们的积累可能对细胞造成氧化损伤。SOD能催化超氧阴离子为过氧化氢，这一过程是细胞清除有害自由基、防止氧化损伤的初步防御机制；POD则进一步分解过氧化氢，维持细胞内过氧化氢平衡，在叶片衰老的过程中有着重要作用［29］。早衰自交系ldhs1的SOD和POD活性显著降低，直接致使植物细胞中过氧化氢的积聚，从而形成具有破坏性的氧化作用，同时MDA的摩尔质量有显著的提升，MDA是脂质过氧化反应的副产品，可以作为评估细胞膜损伤程度的一个化学指标，当MDA摩尔质量上升时，这表明细胞膜中的脂质受到了更多的氧化损伤，细胞膜的完整性和功能可能受到严重影响，进而致使叶片衰老的程度加剧。因此推测，抗氧化酶活性的降低及由此导致的活性氧累积是致使自交系ldhs1叶片呈现早衰的主要生理因素。此外，活性氧在植物体内积累到一定程度时，会触发一连串的负面效应，导致细胞结构和功能的损伤，进而加速植物衰老的过程，通过透射电子显微镜对衰老叶片的细胞结构观察也证实了这样的结果。
叶片衰老属于一种程序性的细胞死亡过程，除了会被活性氧和植物激素等生理因素所影响外，在很大程度上受到基因精确而细致的调控。根据基因功能可分为以下几类，即叶绿体发育、叶绿素降解、激素信号转导、蛋白酶运输和能量运输代谢等，各个途径既相互独立又彼此协同，一起对叶片衰老过程有秩序地进行调控。水稻中的YGL1基因负责编码一种关键的叶绿素合成酶，这种酶在叶绿素a的生物合成中扮演着中心角色，并且对叶绿体的健康发育至关重要［30］；NYC1和NOL通过编码参与叶绿素b降解的酶，对叶片衰老期间发生的色素降解和生理功能下降具有显著影响［31］。对玉米的研究中发现，绿叶的持续覆盖面积与其产量之间存在明显的正相关性，ZmNAC7促进叶片衰老，该基因表达下调能够明显延缓衰老，同时可增产0.29 t·hm-2［32］。早衰自交系ldhs1叶片中的叶绿素发生大量降解，叶绿体内部基粒和基质解体，充满大量的嗜锇颗粒，遗传分析发现其早衰性状受单显性核基因控制；通过建立亲本和极端混池进行二代测序，并对数据进行BSA-seq分析，通过使用分子标记技术，将目标基因准确地定位于1号染色体上的2个Indel标记InDel-12与InDel-13之间1.06 Mb的范围内，该区间有21个候选基因。通过功能注释分析，其中有3个可能的候选基因：Zm00001eb010990在超敏反应中发挥重要作用，可能响应光调控、生物及非生物胁迫；Zm00001eb011000是一类水解细胞膜和细胞器的水解酶，可能通过某种途径与叶片衰老相联系；Zm00001eb011040在植物的生长发育、抗病反应、激素反应、胁迫反应中起着重要的作用，可能参与调控植物衰老机制。通过对该早衰自交系ldhs1的特性分析和QTL定位，可以作为叶早衰分子机制研究的互补验证和补充，在玉米的遗传改良和衰老机制解析等方面具有重要意义。
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Characteristics analysis and QTL mapping of early leaf senescence traits of maize inbred line ldhs1
